ABSTRACT Previous virulence screens have indicated potential roles during Streptococcus pneumoniae infection for the one-carbon metabolism pathway component Fhs and proline synthesis mediated by ProABC. To define how these metabolic pathways affect S. pneumoniae virulence we have investigated phenotypes and transcription profiles of Δ fhs and Δ proABC strain mutants. S. pneumoniae capsular serotype 6B BHN418 Δ fhs and Δ proABC mutant strains were markedly reduced virulence in mouse models of systemic infection and pneumonia, but were still able to colonise the nasopharynx. Although the Δ fhs and Δ proABC mutant strains grew normally in complete media, both mutant strains had markedly impaired growth in chemically defined medium, human serum and human CSF. The Δ proABC strain also had impaired growth under conditions of osmotic and oxidative stress. When transferred to the serotype 2 D39 S. pneumoniae strain background, the Δ fhs mutation replicated the virulence and growth in serum phenotype of the BHN418 mutation. In contrast, the D39 Δ proABC mutant could cause septicaemia and grow in human serum, indicating the role of this genetic locus during virulence is strain-specific. In human sera the Δ fhs and Δ proABC mutants both had major derangements in global gene transcription affecting multiple but different metabolic pathways, identifying the corresponding S. pneumoniae metabolic functions affected by these genes under infection-related conditions. Our data demonstrate an essential role for the S. pneumoniae one- carbon metabolism and a strain-conditional role for proline biosynthesis for growth in physiological fluids and therefore systemic infection, and further demonstrate the vital importance of bacterial metabolism for disease pathogenesis. Importance Rapid adaptation to grow within the physiological conditions found in the host environment is an essential but poorly understood virulence requirement for systemic pathogens such as Streptococcus pneumoniae . We have now demonstrated an essential role for the one-carbon metabolism pathway and a conditional role depending on strain background for proline biosynthesis for S. pneumoniae growth in serum or CSF and therefore for systemic virulence. RNAseq data demonstrated that loss of one carbon metabolism or proline biosynthesis both have profound but differing effects on S. pneumoniae metabolism in human serum, identifying the metabolic processes dependent on each pathway during systemic infection. These data provide a more detailed understanding of the adaptations required by systemic bacterial pathogens in order to cause infection, and demonstrate that the requirement for some of these adaptations vary between strains from the same species and could therefore underpin strain variations in virulence potential.

ABSTRACT The influence of Streptococcus pneumoniae metabolism on nasal epithelial interactions is under-explored. We have assessed S. pneumoniae mutations affecting glutamate 5 kinase ( proABC ) and formate tetrahydrofolate reductase ( fhs ). A Pia iron transporter ( piaA ) mutation was added to ensure attenuation in Experimental Human Pneumococcal Challenge (EHPC). Epithelial microinvasion by Δ proABC/piaA and Δ fhs/piaA strains was enhanced compared to wild-type (WT) in EHPC and Detroit 562 cell infection. In primary epithelium, acetylated tubulin and β catenin expression was increased following Δ proABC exposure and uteroglobin expression was increased with Δ fhs exposure. In Detroit 562 cells, WT and Δ proABC infection induced an inflammatory epithelial transcriptomic response. The Δ fhs/piaA strain induced primarily cellular stress/ repair gene responses. Differential caspase 3/7/8 activity appeared linked to pneumococcal pneumolysin activity and hydrogen peroxide secretion. Our findings highlight the broad-ranging effects of single gene mutations in pneumococcal metabolism which underlies the complexity of the differences between seemingly closely related pneumococci. GRAPHICAL ABSTRACT Bacterial transcriptomics revealed profound effects of biosynthesis gene mutations on bacterial gene expression under serum stress, with upregulation of bacterial virulence factors such as pneumolysin and hydrogen peroxide regulator genes (e.g. spxB) . Epithelial microinvasion by the isogenic mutants was increased compared to wild type strain, but bacterial load was not sufficient to account for the differences observed in epithelial gene expression. Deletion of the fhs gene induced a more intrinsic cellular stress and repair response, compared to the wild-type strain or deletion of the proABC operons which induced a more typical pro-inflammatory response. Differential effects were also seen in cellular re-modelling and caspase activity. We postulate that this link between bacterial metabolism and virulence under conditions of stress will ultimately influence the outcome of colonisation in terms of transmission potential, transition to disease and generation of protective immunity.

Streptococcus pneumoniae, a common coloniser of the upper respiratory tract, invades nasopharyngeal epithelial cells without causing disease in healthy people. We hypothesised that surface expression of pneumococcal lipoproteins, recognised by the innate immune receptor TLR2, mediate epithelial microinvasion. Mutation of lgt in serotype 4 (TIGR4) and serotype 6B (BHN418) pneumococcal strains abolishes the ability of the mutants to activate TLR2 signalling. Loss of lgt also led to concomitant decrease in interferon signalling triggered by the bacterium. However, only BHN418 lgt::cm but not TIGR4 lgt::cm was significantly attenuated in epithelial adherence and microinvasion compared to their respective wild-type strains. To test the hypothesis that differential lipoprotein repertoires in TIGR4 and BHN418 lead to the intraspecies variation in epithelial microinvasion, we employed a motif-based genome analysis and identified an additional 525 a.a. lipoprotein (pneumococcal accessory lipoprotein A; palA) encoded by BHN418 that is absent in TIGR4. The gene encoding palA sits within a putative genetic island present in ~10% of global pneumococcal isolates. While palA was enriched in carriage and otitis media pneumococcal strains, neither mutation nor overexpression of the gene encoding this lipoprotein significantly changed microinvasion patterns. In conclusion, mutation of lgt attenuates epithelial inflammatory responses during pneumococcal-epithelial interactions, with intraspecies variation in the effect on microinvasion. Differential lipoprotein repertoires encoded by the different strains do not explain these differences in microinvasion. Rather, we postulate that post-translational modifications of lipoproteins may account for the differences in microinvasion.

In humans, DNA methylation marks inherited from sperm and egg are largely erased immediately following conception, prior to construction of the embryonic methylome. Exploiting a natural experiment of cyclical seasonal variation including changes in diet and nutritional status in rural Gambia, we replicated 125 loci with a common season-of- conception methylation signature in two independent child cohorts, providing evidence of environmental effects on DNA methylation in the early embryo that persist at least until mid-childhood. Bioinformatic analysis revealed that these loci were highly enriched for metastable epialleles, parent-of-origin specific methylation and regions hypomethylated in sperm, and for H3K9me3 and H3K27me3 histone marks in multiple tissues. They tended to co-locate with endogenous retroviral (ERV1, ERVK) elements. Identified loci were influenced but not determined by measured genetic variation, notably through gene- environment interactions. To the extent that early methylation changes impact gene expression, environmental sensitivity during early embryo genomic remethylation could thus constitute a sense-record-adapt mechanism linking early environment to later phenotype.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Introduction: Campylobacter is a leading cause of bacterial gastroenteritis globally, but its molecular epidemiology remains poorly understood in sub-Saharan Africa. This study investigates the genotypic population structure of Campylobacter jejuni isolates from children with moderate-to-severe diarrhoea (MSD) and healthy controls in The Gambia. Additionally, we determined the antimicrobial susceptibility levels of the isolates. Methods: As part of the Global Enteric Multicenter Study (GEMS) in The Gambia, a total of 49 C. jejuni isolates were collected from the stools of children under 5 years old, including 22 with MSD and 27 healthy controls. These isolates were subjected to multilocus sequence typing (MLST) and antimicrobial susceptibility testing using the disc-diffusion method. Results: The C. jejuni isolates belonged to 22 sequence types (STs), ten of which were novel. The most common STs were ST-353 (19.1%, 9/47), ST-7784 (12.7%, 6/47), and ST-1038 (10.6%, 5/47). All isolates were fully susceptible to erythromycin, tetracycline, gentamicin and chloramphenicol, with two isolates (4.4%, 2/45) resistant to ciprofloxacin and nalidixic acid. Antimicrobial resistance or intermediate susceptibility to trimethoprim-sulfamethoxazole, cefotaxime and ampicillin was observed in 91.1% (41/45), 90.9% (40/44), and 44.4% (20/45) of the isolates, respectively. There was no strong evidence linking C. jejuni antimicrobial susceptibility or MLST genotype to MSD status. Conclusion: This study provides the first overview of the high genotypic diversity of human C. jejuni isolates in The Gambia and reveals low-level resistance among the isolates to antibiotics commonly used to treat campylobacteriosis. The study contributes to understanding the epidemiology and resistance patterns of C. jejuni in this region.

Abstract Human height is strongly influenced by genetics but the contribution of modifiable epigenetic factors is under-explored, particularly in low and middle-income countries (LMIC). We investigated links between blood DNA methylation and child height in four LMIC cohorts (n=1927) and identified a robust association at three CpGs in the suppressor of cytokine signalling 3 ( SOCS3 ) gene which replicated in a high-income country cohort (n=879). SOCS3 methylation ( SOCS3m ) – height associations were independent of genetic effects. Mendelian randomization analysis confirmed a causal effect of SOCS3m on height. In longitudinal analysis in a LMIC cohort, SOCS3m explained a maximum 9.5% of height variance in mid-childhood while the variance explained by height polygenic risk score increased from birth to 21 years (2% to 18%). Children’s SOCS3m was associated with prenatal maternal folate and socio-economic status. In-vitro characterization confirmed a regulatory effect of SOCS3m on gene expression. Our findings suggest that epigenetic modifications may play an important role in driving child height in LMIC.