The evolution of land flora transformed the terrestrial environment. Land plants evolved from an ancestral charophycean alga from which they inherited developmental, biochemical, and cell biological attributes. Additional biochemical and physiological adaptations to land, and a life cycle with an alternation between multicellular haploid and diploid generations that facilitated efficient dispersal of desiccation tolerant spores, evolved in the ancestral land plant. We analyzed the genome of the liverwort Marchantia polymorpha, a member of a basal land plant lineage. Relative to charophycean algae, land plant genomes are characterized by genes encoding novel biochemical pathways, new phytohormone signaling pathways (notably auxin), expanded repertoires of signaling pathways, and increased diversity in some transcription factor families. Compared with other sequenced land plants, M. polymorpha exhibits low genetic redundancy in most regulatory pathways, with this portion of its genome resembling that predicted for the ancestral land plant.PaperClip/cms/asset/a5798ed4-7289-43d4-b493-90cae7386787/mmc12.mp3Loading ...(mp3, 2.95 MB) Download audio

Abstract Abscisic acid (ABA) is involved in a number of critical processes in normal growth and development as well as in adaptive responses to environmental stresses. For correct and accurate actions, a physiologically active ABA level is controlled through fine-tuning of de novo biosynthesis and catabolism. The hydroxylation at the 8′-position of ABA is known as the key step of ABA catabolism, and this reaction is catalyzed by ABA 8′-hydroxylase, a cytochrome P450. Here, we demonstrate CYP707As as the P450 responsible for the 8′-hydroxylation of (+)-ABA. First, all four CYP707A cDNAs were cloned from Arabidopsis and used for the production of the recombinant proteins in insect cells using a baculovirus system. The insect cells expressing CYP707A3 efficiently metabolized (+)-ABA to yield phaseic acid, the isomerized form of 8′-hydroxy-ABA. The microsomes from the insect cells exhibited very strong activity of 8′-hydroxylation of (+)-ABA (K m = 1.3 μ m and k cat = 15 min−1). The solubilized CYP707A3 protein bound (+)-ABA with the binding constant K s = 3.5 μ m, but did not bind (−)-ABA. Detailed analyses of the reaction products confirmed that CYP707A3 does not have the isomerization activity of 8′-hydroxy-ABA to phaseic acid. Further experiments revealed that Arabidopsis CYP707A1 and CYP707A4 also encode ABA 8′-hydroxylase. The transcripts of the CYP707A genes increased in response to salt, osmotic, and dehydration stresses as well as ABA. These results establish that the CYP707A family plays a key role in regulating the ABA level through the 8′-hydroxylation of (+)-ABA.

We have developed a highly sensitive and high-throughput method for the simultaneous analysis of 43 molecular species of cytokinins, auxins, ABA and gibberellins. This method consists of an automatic liquid handling system for solid phase extraction and ultra-performance liquid chromatography (UPLC) coupled with a tandem quadrupole mass spectrometer (qMS/MS) equipped with an electrospray interface (ESI; UPLC-ESI-qMS/MS). In order to improve the detection limit of negatively charged compounds, such as gibberellins, we chemically derivatized fractions containing auxin, ABA and gibberellins with bromocholine that has a quaternary ammonium functional group. This modification, that we call ‘MS-probe’, makes these hormone derivatives have a positive ion charge and permits all compounds to be measured in the positive ion mode with UPLC-ESI-qMS/MS in a single run. Consequently, quantification limits of gibberellins increased up to 50-fold. Our current method needs <100 mg (FW) of plant tissues to determine phytohormone profiles and enables us to analyze >180 plant samples simultaneously. Application of this method to plant hormone profiling enabled us to draw organ distribution maps of hormone species in rice and also to identify interactions among the four major hormones in the rice gibberellin signaling mutants, gid1-3, gid2-1 and slr1. Combining the results of hormone profiling data with transcriptome data in the gibberellin signaling mutants allows us to analyze relationships between changes in gene expression and hormone metabolism.

Glycyrrhizin, a major bioactive compound derived from the underground parts of Glycyrrhiza (licorice) plants, is a triterpene saponin that possesses a wide range of pharmacological properties and is used worldwide as a natural sweetener. Because of its economic value, the biosynthesis of glycyrrhizin has received considerable attention. Glycyrrhizin is most likely derived from the triterpene β-amyrin, an initial product of the cyclization of 2,3-oxidosqualene. The subsequent steps in glycyrrhizin biosynthesis are believed to involve a series of oxidative reactions at the C-11 and C-30 positions, followed by glycosyl transfers to the C-3 hydroxyl group; however, no genes encoding relevant oxidases or glycosyltransferases have been identified. Here we report the successful identification of CYP88D6 , a cytochrome P450 monooxygenase (P450) gene, as a glycyrrhizin-biosynthetic gene, by transcript profiling-based selection from a collection of licorice expressed sequence tags (ESTs). CYP88D6 was characterized by in vitro enzymatic activity assays and shown to catalyze the sequential two-step oxidation of β-amyrin at C-11 to produce 11-oxo-β-amyrin, a possible biosynthetic intermediate between β-amyrin and glycyrrhizin. CYP88D6 coexpressed with β-amyrin synthase in yeast also catalyzed in vivo oxidation of β-amyrin to 11-oxo-β-amyrin. CYP88D6 expression was detected in the roots and stolons by RT-PCR; however, no amplification was observed in the leaves or stems, which is consistent with the accumulation pattern of glycyrrhizin in planta . These results suggest a role for CYP88D6 as a β-amyrin 11-oxidase in the glycyrrhizin pathway.

The 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (2OGD) superfamily is the second largest enzyme family in the plant genome, and its members are involved in various oxygenation/hydroxylation reactions. Despite their biochemical significance in metabolism, a systematic analysis of plant 2OGDs remains to be accomplished. We present a phylogenetic classification of 479 2OGDs in six plant models, ranging from green algae to angiosperms. These were classified into three classes - DOXA, DOXB and DOXC - based on amino acid sequence similarity. The DOXA class includes plant homologs of Escherichia coli AlkB, which is a prototype of 2OGD involved in the oxidative demethylation of alkylated nucleic acids and histones. The DOXB class is conserved across all plant taxa and is involved in proline 4-hydroxylation in cell wall protein synthesis. The DOXC class is involved in specialized metabolism of various phytochemicals, including phytohormones and flavonoids. The vast majority of 2OGDs from land plants were classified into the DOXC class, but only seven from Chlamydomonas, suggesting that this class has diversified during land plant evolution. Phylogenetic analysis assigned DOXC-class 2OGDs to 57 phylogenetic clades. 2OGD genes involved in gibberellin biosynthesis were conserved among vascular plants, and those involved in flavonoid and ethylene biosynthesis were shared among seed plants. Several angiosperm-specific clades were found to be involved in various lineage-specific specialized metabolisms, but 31 of the 57 DOXC-class clades were only found in a single species. Therefore, the evolution and diversification of DOXC-class 2OGDs is partly responsible for the diversity and complexity of specialized metabolites in land plants.

Abstract Glycyrrhizin, a triterpenoid saponin derived from the underground parts of Glycyrrhiza plants (licorice), has several pharmacological activities and is also used worldwide as a natural sweetener. The biosynthesis of glycyrrhizin involves the initial cyclization of 2,3-oxidosqualene to the triterpene skeleton β-amyrin, followed by a series of oxidative reactions at positions C-11 and C-30, and glycosyl transfers to the C-3 hydroxyl group. We previously reported the identification of a cytochrome P450 monooxygenase (P450) gene encoding β-amyrin 11-oxidase (CYP88D6) as the initial P450 gene in glycyrrhizin biosynthesis. In this study, a second relevant P450 (CYP72A154) was identified and shown to be responsible for C-30 oxidation in the glycyrrhizin pathway. CYP72A154 expressed in an engineered yeast strain that endogenously produces 11-oxo-β-amyrin (a possible biosynthetic intermediate between β-amyrin and glycyrrhizin) catalyzed three sequential oxidation steps at C-30 of 11-oxo-β-amyrin supplied in situ to produce glycyrrhetinic acid, a glycyrrhizin aglycone. Furthermore, CYP72A63 of Medicago truncatula, which has high sequence similarity to CYP72A154, was able to catalyze C-30 oxidation of β-amyrin. These results reveal a function of CYP72A subfamily proteins as triterpene-oxidizing enzymes and provide a genetic tool for engineering the production of glycyrrhizin.

Triterpenoids are a diverse group of secondary metabolites that are associated with a variety of biological activities. Oleanolic acid, ursolic acid and betulinic acid are common triterpenoids in plants with diverse biological activities, including antifungal, antibacterial, anti-human immunodeficiency virus (HIV) and/or antitumor activities. In the present study, using the gene co-expression analysis tool of Medicago truncatula, we found a strong correlation between CYP716A12 and β-amyrin synthase (bAS), which encodes the enzyme responsible for the initial cyclization of 2,3-oxidosqualene to β-amyrin (the basic structural backbone of most triterpenoid saponins). Through an in vitro assay, we identified CYP716A12 as a β-amyrin 28-oxidase able to modify β-amyrin to oleanolic acid (through erythrodiol and, possibly, oleanolic aldehyde). We also confirmed its activity in vivo, by expressing CYP716A12 in transgenic yeast that endogenously produce β-amyrin. In addition, CYP716A12 was evaluated for its potential α-amyrin- and lupeol-oxidizing activities. Interestingly, CYP716A12 was able to generate ursolic acid (through uvaol and, possibly, ursolic aldehyde) and betulinic acid (through betulin). Hence, CYP716A12 was characterized as a multifunctional enzyme with β-amyrin 28-oxidase, α-amyrin 28-oxidase and lupeol 28-oxidase activities. We also identified homologs of CYP716A12 in grape (CYP716A15 and CYP716A17) that are involved in triterpenoid biosynthesis, which indicates the highly conserved functionality of the CYP716A subfamily among plants. These findings will be useful in the heterologous production of pharmacologically and industrially important triterpenoids, including oleanolic acid, ursolic acid and betulinic acid.

Strigolactones (SLs) are plant apocarotenoids with diverse roles and structures. Canonical SLs, widespread and characterized by structural variations in their tricyclic lactone (ABC-ring), are classified into two types based on C-ring configurations. The steric C-ring configuration emerges during the BC-ring closure, downstream of the biosynthetic intermediate, carlactonoic acid (CLA). Most plants produce either type of canonical SLs stereoselectively, e.g., tomato (

Abstract Strigolactones (SLs) are plant apocarotenoids with diverse functions and structures. The widespread canonical SLs, with distinctive structural variations in their tricyclic lactone known as the ABC-ring, are classified into two types based on the C-ring configurations. The steric C-ring configuration arises during the BC-ring closure downstream of carlactonoic acid (CLA), a biosynthetic intermediate. Most plants stereoselectively produce either type of canonical SLs, e.g., tomato ( Solanum lycopersicum ) produces orobanchol with α-oriented C-ring. The mechanisms governing SL structural diversification are partly understood, with limited insight into the functional implications. Moreover, the precise molecular mechanism for the stereoselective BC-ring closure reaction remains unknown. Herein, we identified an enzyme called the stereoselective BC-ring-forming factor (SRF) from the dirigent protein (DIR) family, especially the DIR-f subfamily, whose biochemical function was previously unidentified, making it a pivotal enzyme in stereoselective canonical SL biosynthesis with the α-oriented C-ring. We begin by confirming the exact catalytic function of the tomato cytochrome P450 SlCYP722C, which we previously demonstrated to be involved in the orobanchol biosynthesis [Wakabayashi et al., Sci. Adv. 5 , eaax9067 (2019)], to convert CLA to 18-oxocarlactonoic acid. Subsequently, we demonstrate that SRF catalyzes the stereoselective BC-ring closure reaction of 18-oxocarlactonoic acid to form orobanchol. Our approach integrates experimental and computational methods, including SRF structure prediction and molecular dynamics simulations, to propose a catalytic mechanism based on the conrotatory 4π-electrocyclic reaction for stereoselective BC-ring formation in orobanchol. The present study provides insight into the molecular basis of how plants produce SLs with specific stereochemistry in a controlled manner.