During embryogenesis, yolk-sac and intra-embryonic-derived hematopoietic progenitors, comprising the precursors of adult hematopoietic stem cells, converge into the fetal liver. With a new staining strategy, we defined all non-hematopoietic components of the fetal liver and found that hepatoblasts are the major producers of hematopoietic growth factors. We identified mesothelial cells, a novel component of the stromal compartment, producing Kit ligand, a major hematopoietic cytokine. A high-definition imaging dataset analyzed using a deep-learning based pipeline allowed the unambiguous identification of hematopoietic and stromal populations, and enabled determining a neighboring network composition, at the single cell resolution. Throughout active hematopoiesis, progenitors preferentially associate with hepatoblasts, but not with stellate or endothelial cells. We found that, unlike yolk sac-derived progenitors, intra-embryonic progenitors respond to a chemokine gradient created by CXCL12-producing stellate cells. These results revealed that FL hematopoiesis is a spatiotemporal dynamic process, defined by an environment characterized by low cytokine concentrations.

Multiple waves of hematopoietic progenitors with distinct lineage potentials are differentially regulated in time and space. We show that the first thymic seeding progenitors comprise a unique population of bipotent cells that generate lymphoid tissue inducer and invariant V γ 5+ T cells. Both populations are of embryonic origin and induce the maturation of medullary thymic epithelial cells. Indeed, temporal depletion of the first wave of thymocytes results in a five-fold reduction of mature medullary thymic epithelial cells, after birth. We further show that these progenitors are of hematopoietic stem cell, and not, of yolk sac origin, despite the temporal overlap between the onset of lymphopoiesis and the transient expression of lymphoid transcripts in yolk sac precursors, that does not impact their strict erythro-myeloid potential. Our work highlights the relevance of the developmental timing on the emergence of different lymphoid subsets required for the establishment of a functionally diverse immune system.

Embryonic hematopoiesis consists of distinct waves originating in rapid succession from different anatomical locations. Hematopoietic progenitors appearing earlier than definitive hematopoietic stem cells (HSCs) play key roles in fetal and postnatal life. However, their precise origin, identity and the extent of their contribution need further clarification. To this aim, we took advantage of a genetic fate-mapping strategy in mice that allows labeling and tracking of distinct subsets of hemogenic endothelium (HE). Time-course labeling of hematopoietic progenitors emerging from HE between E8.5 and E9.5, before intra-embryonic definitive HSC generation, revealed a major fetal lympho-myeloid contribution which declined in the adult. Lineage tracing coupled with whole-mount imaging and single-cell RNA sequencing located its source within hematopoietic clusters of vitelline and umbilical arteries. Functional assays confirmed the transient nature of these progenitors. We therefore unveiled a hitherto unidentified early wave of fetal-restricted hematopoietic stem/progenitor cells poised for differentiation that provide a major contribution to pre-natal hematopoiesis.

The first hematopoietic cells are produced in the yolk sac and are thought to be rapidly replaced by the progeny of hematopoietic stem cells. Here we document that hematopoietic stem cells do not contribute significantly to erythrocyte production up until birth. Lineage tracing of yolk sac-derived erythromyeloid progenitors, that also contribute to tissue resident macrophages, shows a progeny of highly proliferative erythroblasts, that after intra embryonic injection, rapidly differentiate. These progenitors, similar to hematopoietic stem cells, are c-Myb dependent and are developmentally restricted as they are not found in the bone marrow. We show that erythrocyte progenitors of yolk sac origin require lower concentrations of erythropoietin than their hematopoietic stem cell-derived counterparts for efficient erythrocyte production. Consequently, fetal liver hematopoietic stem cells fail to generate megakaryocyte and erythrocyte progenitors. We propose that large numbers of yolk sac-derived erythrocyte progenitors have a selective advantage and efficiently outcompete hematopoietic stem cell progeny in an environment with limited availability of erythropoietin.

Abstract The fetal liver is the main hematopoietic organ during embryonic development. The fetal liver is also the unique anatomical site where hematopoietic stem cells expand before colonizing the bone marrow, where they ensure life-long blood cell production and become mostly resting. The identification of the different cell types that comprise the hematopoietic stroma in the fetal liver is essential to understand the signals required for the expansion and differentiation of the hematopoietic stem cells. We used a panel of monoclonal antibodies to identify fetal liver stromal cells in a 5-laser equipped spectral flow cytometry analyzer. The “Autofluorescence Finder” of SONY ID7000 software identified two distinct autofluorescence emission spectra. Using autofluorescence as a fluorescence parameter we could assign the two autofluorescent signals to three distinct cell types and identified surface markers that characterize these populations. We found that one autofluorescent population corresponds to hepatoblasts and cholangiocytes whereas the other expresses mesenchymal transcripts and was identified as stellate cells. Importantly, after birth, autofluorescence becomes the unique identifying property of hepatoblasts because mature cholangiocytes are no longer autofluorescent. These results show that autofluorescence used as a parameter in spectral flow cytometry is a useful tool to identify new cell subsets that are difficult to analyze in conventional flow cytometry.

Abstract The epicardium is a reservoir of progenitors that give rise to coronary vasculature and stroma during development and mediates cardiac vascular repair in lower vertebrates. However, its role as a source of progenitors in the adult mammalian heart remains unclear due to lack of clear lineage markers and single-cell culture systems to elucidate epicardial progeny cell fate. We found that in vivo exposure of mice to physiological hypoxia induced adult epicardial cells to re-enter the cell cycle and to express a subset of developmental genes. Multiplex transcriptional profiling revealed a lineage relationship between epicardial cells and smooth muscle, stromal, and endothelial fates, and that physiological hypoxia promoted an endothelial cell fate. In vitro analyses of purified epicardial cells showed that cell growth and subsequent differentiation is dependent upon hypoxia, and that resident epicardial cells retain progenitor identity in the adult mammalian heart with self-renewal and multilineage differentiation potential. These results point to a source of progenitor cells in the adult heart that can promote heart revascularization, providing an invaluable in vitro model for further studies.