Abstract Gut-associated lymphoid tissue (GALT) is organised lymphoid tissue that is chronically activated by the intestinal microbiota. It generates the IgA response that is critical for intestinal homeostasis. By iterative application of multiplexed technologies, we identify enrichment of double-negative 2 (DN2:CD27 - IgD - CD21 lo CD11c hi ) B cells in GALT, where they comprise the majority of intraepithelial and subepithelial B cells. We show that DN2 B cells in GALT interact with DC in the sub-epithelial dome that express DNASE1L3 and microbicides. Unlike in mice, DNASE1L3 in humans does not associate with apoptotic debris, but is located between sampled bacteria and host tissue where it is co-expressed with C1Q , consistent with management of bacterial debris. Thus we demonstrate that DN2 B cells that are otherwise associated with lupus nephritis, and DNASE1L3 and C1q that are lupus autoantigens, are microbiota-associated, interacting components of normal intestinal immunity.

ABSTRACT Colorectal cancers (CRCs) show variable response to immune checkpoint blockade, which can only partially be explained by the variability of tumour mutational burden. To dissect the cellular and molecular determinants of response we performed a multi-omic screen of 721 cancer regions from patients treated with Pembrolizumab (KEYNOTE 177 clinical trial) or Nivolumab. Multi-regional whole exome, RNA and T-cell receptor sequencing show that, within hypermutated CRCs, response to both anti-PD1 agents is not positively associated with tumour mutational burden but with high clonality of immunogenic mutations, expanded T cells, low activation of the WNT pathway and active immune escape mechanisms. Coupling high-dimensional imaging mass cytometry with multiplexed immunofluorescence and computational spatial analysis, we observe that responsive hypermutated CRCs are rich in cytotoxic and proliferating PD1-expressing CD8 cells interacting with high-density clusters of PDL1-expressing antigen presenting macrophages. We propose that anti-PD1 agents release the PD1-PDL1 interaction between CD8 T cells and macrophages thus promoting cytotoxic anti-tumour activity.

Abstract Background Cell type identification plays an important role in the analysis and interpretation of single-cell data and can be carried out via supervised or unsupervised clustering approaches. Supervised methods are best suited where we can list all cell types and their respective marker genes a priori . While unsupervised clustering algorithms look for groups of cells with similar expression properties. This property permits the identification of both known and unknown cell populations, making unsupervised methods suitable for discovery.. Success is dependent on the relative strength of the expression signature of each group as well as the number of cells. Rare cell types therefore present a particular challenge that are magnified when they are defined by differentially expressing a small number of genes. Typical unsupervised approaches fail to identify such rare subpopulations, and these cells tend to be absorbed into more prevalent cell types. Results In order to balance these competing demands, we have developed a novel statistical framework for unsupervised clustering, named Rarity, that enables the discovery process for rare cell types to be more robust, consistent and interpretable. We achieve this by devising a novel clustering method based on a Bayesian latent variable model in which we assign cells to inferred latent binary on/off expression profiles. This lets us achieve increased sensitivity to rare cell populations while also allowing us to control and interpret potential false positive discoveries. Conclusions We systematically study the challenges associated with rare cell type identification and demonstrate the utility of Rarity on various IMC data sets.

ABSTRACT Multiplexed imaging technologies enable the study of biological tissues at single-cell resolution while preserving spatial information. Currently, high-dimension imaging data analysis is technology-specific and requires multiple tools, restricting analytical scalability and result reproducibility. Here we present SIMPLI (Single-cell Identification from MultiPlexed Images), a novel, flexible and technology-agnostic software that unifies all steps of multiplexed imaging data analysis. After raw image processing, SIMPLI performs a spatially resolved, single-cell analysis of the tissue slide as wells as cell-independent quantifications of marker expression to investigate features undetectable at the cell level. SIMPLI is highly customisable and can run on desktop computers as well as high-performance computing environments, enabling workflow parallelisation for large datasets. SIMPLI produces multiple tabular and graphical outputs at each step of the analysis. Its containerised implementation and minimum configuration requirements make SIMPLI a portable and reproducible solution for multiplexed imaging data analysis. SIMPLI is available at: https://github.com/ciccalab/SIMPLI .

ABSTRACT Genetic alterations of somatic cells can drive nonmalignant clone formation and promote cancer initiation. However, the link between these processes remains unclear hampering our understanding of tissue homeostasis and cancer development. Here we collect a literature-based repertoire of 3355 well-known or predicted drivers of cancer and noncancer somatic evolution in 122 cancer types and 12 noncancer tissues. Mapping the alterations of these genes in 7953 pancancer samples reveals that, despite the large size, the known compendium of drivers is still incomplete and biased towards frequently occurring coding mutations. High overlap exists between drivers of cancer and noncancer somatic evolution, although significant differences emerge in their recurrence. We confirm and expand the unique properties of drivers and identify a core of evolutionarily conserved and essential genes whose germline variation is strongly counter-selected. Somatic alteration in even one of these genes is sufficient to drive clonal expansion but not malignant transformation. Our study offers a comprehensive overview of our current understanding of the genetic events initiating clone expansion and cancer revealing significant gaps and biases that still need to be addressed. The compendium of cancer and noncancer somatic drivers, their literature support and properties are accessible at http://www.network-cancer-genes.org/ .

Abstract Confirmed SARS-coronavirus-2 infection with gastrointestinal symptoms and changes in microbiota associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19) severity have been previously reported, but the disease impact on the architecture and cellularity of ileal Peyer’s patches (PP) remains unknown. Here we analysed post-mortem tissues from throughout the gastrointestinal (GI) tract of patients who died with COVID-19. When virus was detected by PCR in the GI tract, immunohistochemistry identified virus in epithelium and lamina propria macrophages, but not in lymphoid tissues. Immunohistochemistry and imaging mass cytometry (IMC) analysis of ileal PP revealed depletion of germinal centres (GC), disruption of B cell/T cell zonation and decreased potential B and T cell interaction and lower nuclear density in COVID-19 patients. This occurred independent of the local viral levels. The changes in PP demonstrate that the ability to mount an intestinal immune response is compromised in severe COVID-19, which could contribute to observed dysbiosis.