The mitochondrial theory of aging proposes that reactive oxygen species (ROS) generated inside the cell will lead, with time, to increasing amounts of oxidative damage to various cell components. The main site for ROS production is the respiratory chain inside the mitochondria and accumulation of mtDNA mutations, and impaired respiratory chain function have been associated with degenerative diseases and aging. The theory predicts that impaired respiratory chain function will augment ROS production and thereby increase the rate of mtDNA mutation accumulation, which, in turn, will further compromise respiratory chain function. Previously, we reported that mice expressing an error-prone version of the catalytic subunit of mtDNA polymerase accumulate a substantial burden of somatic mtDNA mutations, associated with premature aging phenotypes and reduced lifespan. Here we show that these mtDNA mutator mice accumulate mtDNA mutations in an approximately linear manner. The amount of ROS produced was normal, and no increased sensitivity to oxidative stress-induced cell death was observed in mouse embryonic fibroblasts from mtDNA mutator mice, despite the presence of a severe respiratory chain dysfunction. Expression levels of antioxidant defense enzymes, protein carbonylation levels, and aconitase enzyme activity measurements indicated no or only minor oxidative stress in tissues from mtDNA mutator mice. The premature aging phenotypes in mtDNA mutator mice are thus not generated by a vicious cycle of massively increased oxidative stress accompanied by exponential accumulation of mtDNA mutations. We propose instead that respiratory chain dysfunction per se is the primary inducer of premature aging in mtDNA mutator mice.

There is an intense debate concerning whether selection or demographics has been most important in shaping the sequence variation observed in modern human mitochondrial DNA (mtDNA). Purifying selection is thought to be important in shaping mtDNA sequence evolution, but the strength of this selection has been debated, mainly due to the threshold effect of pathogenic mtDNA mutations and an observed excess of new mtDNA mutations in human population data. We experimentally addressed this issue by studying the maternal transmission of random mtDNA mutations in mtDNA mutator mice expressing a proofreading-deficient mitochondrial DNA polymerase. We report a rapid and strong elimination of nonsynonymous changes in protein-coding genes; the hallmark of purifying selection. There are striking similarities between the mutational patterns in our experimental mouse system and human mtDNA polymorphisms. These data show strong purifying selection against mutations within mtDNA protein-coding genes. To our knowledge, our study presents the first direct experimental observations of the fate of random mtDNA mutations in the mammalian germ line and demonstrates the importance of purifying selection in shaping mitochondrial sequence diversity.

Abstract Loss-of-function variants in the PRKN gene encoding the ubiquitin E3 ligase PARKIN cause autosomal recessive early-onset Parkinson’s disease (PD). Extensive in vitro and in vivo studies have reported that PARKIN is involved in multiple pathways of mitochondrial quality control, including mitochondrial degradation and biogenesis. However, these findings are surrounded by substantial controversy due to conflicting experimental data. In addition, the existing PARKIN-deficient mouse models have failed to faithfully recapitulate PD phenotypes. Therefore, we have investigated the mitochondrial role of PARKIN during ageing and in response to stress by employing a series of conditional Parkin knockout mice. We report that PARKIN loss does not affect oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity and mitochondrial DNA (mtDNA) levels in the brain, heart, and skeletal muscle of aged mice. We also demonstrate that PARKIN deficiency does not exacerbate the brain defects and the pro-inflammatory phenotype observed in mice carrying high levels of mtDNA mutations. To rule out compensatory mechanisms activated during embryonic development of Parkin -deficient mice, we generated a mouse model where loss of PARKIN was induced in adult dopaminergic (DA) neurons. Surprisingly, also these mice did not show motor impairment or neurodegeneration, and no major transcriptional changes were found in isolated midbrain DA neurons. Finally, we report a patient with compound heterozygous PRKN pathogenic variants that lacks PARKIN and has developed PD. The PARKIN deficiency did not impair OXPHOS activities or induce mitochondrial pathology in skeletal muscle from the patient. Altogether, our results argue that PARKIN is dispensable for OXPHOS function in adult mammalian tissues.

Drosophila melanogaster has been a working horse of genetics and cell biology for more than a century. However, proteomic-based methods have been limited due to technical obstacles, especially the lack of reliable labelling methods. Here, we advanced a chemically defined food source into stable-isotope labelling of amino acids in flies (SILAF). It allows for the rapid generation of a large number of flies with full incorporation of lysine-6. SILAF followed by fractionation and enrichment gave proteomic insights at a depth of 5,966 proteins and 7,496 phosphorylation sites, which substantiated metabolic regulation on enzymatic level. Furthermore, the label can be traced and predicts protein turnover rates during different developmental stages. The ease and versatility of the method actuates the fruit fly as an appealing model in proteomic and post-translational modification studies and it enlarges potential metabolic applications based on heavy amino acid diets.