Investigating chromosomal instability and aneuploidy within tumors is essential for understanding their contribution to tumorigenesis and developing effective diagnostic and therapeutic strategies. Single-cell DNA sequencing (scDNA-seq) technologies have enabled such analyses, revealing aneuploidies specific to individual cells within the same tumor. However, scaling the throughput of these methods to identify aneuploidies occurring at low frequencies while maintaining high sensitivity has been difficult. To overcome this, we developed KaryoTap, a method combining custom targeted panels for the Tapestri scDNA-seq platform with a Gaussian mixture model analysis framework to enable detection of chromosome- and chromosome arm-scale aneuploidy in all human chromosomes across thousands of single cells simultaneously. This system will prove a powerful and flexible resource for the study of aneuploidy and chromosomal instability in tumors and normal tissues.

SUMMARY Aneuploidy, the presence of chromosome gains or losses, is a hallmark of cancer and congenital syndromes. Here, we describe KaryoCreate ( Karyo type CR ISPR E ngineered A neuploidy Te chnology), a system that enables generation of chromosome-specific aneuploidies by co-expression of a sgRNA targeting chromosome-specific CENPA-binding ɑ-satellite repeats together with dCas9 fused to a mutant form of KNL1. We designed unique and highly specific sgRNAs for 19 out of 24 chromosomes. Expression of these sgRNAs with KNL1 Mut -dCas9 leads to missegregation and induction of gains or losses of the targeted chromosome in cellular progeny with an average efficiency of 8% and 12% for gains and losses, respectively (up to 20%), tested and validated across 9 chromosomes. Using KaryoCreate in colon epithelial cells, we show that chromosome 18q loss, a frequent occurrence in gastrointestinal cancers, promotes resistance to TGFβ, likely due to synergistic hemizygous deletion of multiple genes. Altogether, we describe a novel technology to create and study chromosome missegregation and aneuploidy in the context of cancer and beyond. Highlights We designed sgRNAs targeting chromosome-specific centromeres across 19 human chromosomes KaryoCreate combines chromosome-specific centromeric sgRNAs with dCas9 fused to a mutant form of KNL1. KaryoCreate allows engineering gains and losses of specific human chromosomes. Engineered Chromosome 18q loss promotes tumor-associated phenotypes in colon-derived cells. KaryoCreate is a CRISPR-based technology to foster the study of centromere biology and aneuploidy.