Sirtuins (SIRTs) are critical enzymes that govern genome regulation, metabolism, and aging. Despite conserved deacetylase domains, mitochondrial SIRT4 and SIRT5 have little to no deacetylase activity, and a robust catalytic activity for SIRT4 has been elusive. Here, we establish SIRT4 as a cellular lipoamidase that regulates the pyruvate dehydrogenase complex (PDH). Importantly, SIRT4 catalytic efficiency for lipoyl- and biotinyl-lysine modifications is superior to its deacetylation activity. PDH, which converts pyruvate to acetyl-CoA, has been known to be primarily regulated by phosphorylation of its E1 component. We determine that SIRT4 enzymatically hydrolyzes the lipoamide cofactors from the E2 component dihydrolipoyllysine acetyltransferase (DLAT), diminishing PDH activity. We demonstrate SIRT4-mediated regulation of DLAT lipoyl levels and PDH activity in cells and in vivo, in mouse liver. Furthermore, metabolic flux switching via glutamine stimulation induces SIRT4 lipoamidase activity to inhibit PDH, highlighting SIRT4 as a guardian of cellular metabolism.

ABSTRACT Peg10 (paternally expressed gene 10) is an imprinted gene that is essential for placental development. It is thought to derive from a Ty3-gyspy LTR (long terminal repeat) retrotransposon and retains Gag and Pol-like domains. Here we show that the Gag domain of PEG10 can promote vesicle budding similar to the HIV p24 Gag protein. Expressed in a subset of mouse endocrine organs in addition to the placenta, PEG10 was identified as a substrate of the deubiquitinating enzyme USP9X. Consistent with PEG10 having a critical role in placental development, PEG10-deficient trophoblast stem cells (TSCs) exhibited impaired differentiation into placental lineages. PEG10 expressed in wild-type, differentiating TSCs was bound to many cellular RNAs including Hbegf (Heparin-binding EGF-like growth factor), which is known to play an important role in placentation. Expression of Hbegf was reduced in PEG10-deficient TSCs suggesting that PEG10 might bind to and stabilize RNAs that are critical for normal placental development.

Abstract INTRODUCTION Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) agonists are being clinically evaluated as disease‐modifying therapeutics for Alzheimer's disease. Clinically translatable pharmacodynamic (PD) biomarkers are needed to confirm drug activity and select the appropriate therapeutic dose in clinical trials. METHODS We conducted multi‐omic analyses on paired non‐human primate brain and cerebrospinal fluid (CSF), and stimulation of human induced pluripotent stem cell–derived microglia cultures after TREM2 agonist treatment, followed by validation of candidate fluid PD biomarkers using immunoassays. We immunostained microglia to characterize proliferation and clustering. RESULTS We report CSF soluble TREM2 (sTREM2) and CSF chitinase‐3‐like protein 1 (CHI3L1/YKL‐40) as PD biomarkers for the TREM2 agonist hPara.09. The respective reduction of sTREM2 and elevation of CHI3L1 in brain and CSF after TREM2 agonist treatment correlated with transient microglia proliferation and clustering. DISCUSSION CSF CHI3L1 and sTREM2 reflect microglial TREM2 agonism and can be used as clinical PD biomarkers to monitor TREM2 activity in the brain. Highlights CSF soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (sTREM2) reflects brain target engagement for a novel TREM2 agonist, hPara.09. CSF chitinase‐3‐like protein 1 reflects microglial TREM2 agonism. Both can be used as clinical fluid biomarkers to monitor TREM2 activity in brain.

Abstract Intelligent data acquisition (IDA) strategies, such as real-time database search (RTS), have improved the depth of proteome coverage for experiments that utilize isobaric labels and gas phase purification techniques (i.e., SPS-MS3). While most applications of IDA have been focused on the analysis of protein abundance, these approaches have recently been applied to activity-based proteome profiling (ABPP) studies aimed at characterization of protein site engagement by small molecules. In this work, we extend IDA capabilities offered by vendor software through a program called InSeqAPI. First, we demonstrate robust performance of InSeqAPI in the analysis of biotinylated cysteine peptides from ABPP experiments. Then, we describe PairQuant, a method within InSeqAPI designed for the hyperplexing approach that utilizes protein-level isotopic labeling and peptide-level TMT labeling. PairQuant allows for TMT analysis of 36 conditions in a single sample and achieves ∼98% coverage of both peptide pair partners in a hyperplexed experiment as well as a 40% improvement in the number of quantified cysteine sites compared to non-RTS acquisition. We applied this method in ABPP study of ligandable cysteine sites in the nucleus leading to an identification of additional druggable sites on protein-and DNA-interaction domains of transcription regulators and on nuclear ubiquitin ligases.