Abstract Background PacBio high fidelity (HiFi) sequencing reads are both long (15–20 kb) and highly accurate (> Q20). Because of these properties, they have revolutionised genome assembly leading to more accurate and contiguous genomes. In eukaryotes the mitochondrial genome is sequenced alongside the nuclear genome often at very high coverage. A dedicated tool for mitochondrial genome assembly using HiFi reads is still missing. Results MitoHiFi was developed within the Darwin Tree of Life Project to assemble mitochondrial genomes from the HiFi reads generated for target species. The input for MitoHiFi is either the raw reads or the assembled contigs, and the tool outputs a mitochondrial genome sequence fasta file along with annotation of protein and RNA genes. Variants arising from heteroplasmy are assembled independently, and nuclear insertions of mitochondrial sequences are identified and not used in organellar genome assembly. MitoHiFi has been used to assemble 374 mitochondrial genomes (368 Metazoa and 6 Fungi species) for the Darwin Tree of Life Project, the Vertebrate Genomes Project and the Aquatic Symbiosis Genome Project. Inspection of 60 mitochondrial genomes assembled with MitoHiFi for species that already have reference sequences in public databases showed the widespread presence of previously unreported repeats. Conclusions MitoHiFi is able to assemble mitochondrial genomes from a wide phylogenetic range of taxa from Pacbio HiFi data. MitoHiFi is written in python and is freely available on GitHub ( https://github.com/marcelauliano/MitoHiFi ). MitoHiFi is available with its dependencies as a Docker container on GitHub (ghcr.io/marcelauliano/mitohifi:master).

Abstract In intimate ecological interactions, the interdependency of species may result in correlated demographic histories. For species of conservation concern, understanding the long-term dynamics of such interactions may shed light on the drivers of population decline. Here we address the demographic history of the monarch butterfly, Danaus plexippus , and its dominant host plant, the common milkweed Asclepias syriaca , using broad-scale sampling and genomic inference. Because genetic resources for milkweed have lagged behind those for monarchs, we first release a chromosome-level genome assembly and annotation for common milkweed. Next, we show that despite its enormous geographic range across eastern North America, A. syriaca is best characterized as a single, roughly panmictic population. Using Approximate Bayesian Computation via Random Forests (ABC-RF), a machine learning method for reconstructing demographic histories, we show that both monarchs and milkweed experienced concurrent range expansion during the most recent recession of North American glaciers ∼12,000 years ago. Our data identify an expansion of milkweed during the large-scale clearing of eastern forests (∼200 years ago) but was inconclusive as to expansion or contraction of the monarch butterfly population during this time. Finally, our results indicate that neither species experienced a population contraction over the past 75 years. Thus, the well-documented decline of monarch abundance over the past 40 years is not visible in our genomic dataset, reflecting a possible mismatch of the overwintering census population to effective population size in this species.

Abstract Humans are transforming species ranges worldwide. While artificial translocations trigger biological invasions with negative effects on biodiversity, invasions provide exceptional opportunities to generate ecological and evolutionary hypotheses. Unfortunately, imperfect historical records and exceedingly complex demographic histories present challenges for the reconstruction of invasion histories. Here we combine historical records, extensive worldwide and genome-wide sampling, and demographic analyses to investigate the global invasion of yellow monkeyflowers ( Mimulus guttatus ) from North America to Europe and the Southwest Pacific. By sampling 521 plants from 158 native and introduced populations genotyped at >44,000 loci, we determined that invasive North American M. guttatus was first likely introduced to the British Isles from the Aleutian Islands (Alaska), followed by rapid admixture from multiple parts of the native range. Populations in the British Isles then appear to have served as a bridgehead for vanguard invasions worldwide into the rest of Europe, New Zealand and eastern North America. Our results emphasise the highly admixed nature of introduced M. guttatus and demonstrate the potential of introduced populations to serve as sources of secondary admixture, producing novel hybrids. Unravelling the history of biological invasions provides a starting point to understand how invasive populations adapt to novel environments.

Abstract Polyploidy is pervasive in angiosperm evolution and plays important roles in adaptation and speciation. However, polyploid groups are understudied due to complex sequence homology, challenging genome assembly, and taxonomic complexity. Here we study adaptive divergence in taxonomically complex eyebrights ( Euphrasia ), where recent divergence, phenotypic plasticity and hybridisation blur species boundaries. We focus on three closely-related tetraploid species with contrasting ecological preferences, and which are sympatric on Fair Isle, a small isolated island in the British Isles. Using a common garden experiment, we show a genetic component to the morphological differences present between these species. Using whole genome sequencing and a novel k -mer approach, we demonstrate an allopolyploid origin, with sub-genome divergence of approximately 5%. Using ~2 million SNPs we show sub-genome homology across species consistent with a common origin, with very low sequence divergence characteristic of recent speciation. This genetic variation is broadly structured by species, with clear divergence of Fair Isle heathland E. micrantha, while grassland E. arctica and coastal E. foulaensis are more closely related. Overall, we show tetraploid Euphrasia is an allopolyploid system characterised by postglacial species divergence, where adaptation to novel environments may be conferred by old variants rearranged into new genetic lineages.

ABSTRACT Hybridization generates inter-genomic interactions, which may result in unique traits not seen in either parent species. Here we explore the genetic basis of both carotenoid and anthocyanin floral pigmentation in hybrids between monkeyflower species Mimulus cupreus and M. luteus var. variegatus. Mimulus cupreus has abundant yellow carotenoid pigmentation in its petal lobes, while M. l. variegatus has a derived reduction in carotenoid intensity. Thus, as expected, carotenoid intensity segregates in an F2 hybrid population. More surprisingly, both species appear to have petal lobes solidly and identically covered in magenta anthocyanin pigment (which, when overlaid on the bright yellow carotenoid background, leads to an orange color in M. cupreus ), yet F1 and F2 hybrids exhibit novel and complex spatial patterns of anthocyanin spotting. A rare yellow morph of M. cupreus , which lacks petal anthocyanins, also generates spatially patterned offspring when hybridized with M. l. variegatus . We use this cross, together with newly developed high-quality genome assembly of M. l. luteus and image analysis tools, to investigate the genetic architecture of color and pattern variation in an F2 hybrid population. We report a single QTL, containing the Beta-carotene hydroxylase ( BCH ) gene, associated with the non-patterned carotenoid reduction in M. l. variegatus . HPLC shows that relative beta-carotene abundance differs between dark yellow and light yellow petals, supporting a causal role for BCH . The presence versus absence of petal lobe anthocyanin segregates in a 3:1 ratio, and we report (as expected) an associated QTL encompassing the anthocyanin activator MYB5a/NEGAN which has previously been shown to be both necessary and sufficient to activate petal lobe anthocyanins in M. l. variegatus . Anthocyanin patterning was more complex, with seven QTLs associated with five quantitative patterning traits on the upper petals; 11 on the lower petals; and three qualitative whole-flower patterning traits. Although power was too limited to effectively test for epistatic interactions in this cross, the QTLs provide candidate genomic regions for further investigating the molecular mechanisms of spatially complex floral color patterning, and multiple candidate genes are identified including anthocyanin activators and an anthocyanin repressor.

Summary Generalist hemiparasites may attach to many different host species and experience complex parasite-host interactions. How these parasite-host interactions impact on the fitness of hemiparasitic plants remain largely unknown. We used experimentally tractable eyebrights (Euphrasia, Orobanchaceae) to understand parasite-host interactions affecting the performance of a generalist hemiparasitic plant. Common garden experiments were carried out measuring Euphrasia performance across 45 diverse hosts and in different parasite-host combinations. We showed that variation in hemiparasite performance could be attributed mainly to host species and host phylogenetic relationships (λ = 0.82; 0.17-1.00 Cl). When this variation in performance is broken down temporally, annual host species cause earlier flowering, and lead to poorer performance late in the season. While Euphrasia species typically perform similarly on a given host species, some eyebrights show more specialised parasite-host interactions. Our results show that generalist hemiparasites only benefit from attaching to a limited, but phylogenetically divergent, subset of hosts. The conserved responses of divergent Euphrasia species suggest hemiparasite performance is affected by common host attributes. However, evidence for more complex parasite-host interactions show that a generalist hemiparasite can potentially respond to individual host selection pressures and may adapt to local host communities.

Summary Genome size (GS) is a key trait related to morphology, life history, and evolvability. Although GS is, by definition, affected by presence/absence variants (PAVs), which are ubiquitous in population sequencing studies, GS is often treated as an intrinsic property of a species. Here, we studied intra- and interspecific GS variation in taxonomically complex British eyebrights ( Euphrasia ). We generated GS data for 192 individuals of diploid and tetraploid Euphrasia and analysed GS variation in relation to ploidy, taxonomy, population affiliation, and geography. We further compared the genomic repeat content of 30 samples. We found considerable genuine intraspecific GS variation, and observed isolation-by-distance for GS in outcrossing diploids. Tetraploid Euphrasia showed contrasting patterns, with GS increasing with latitude in outcrossing Euphrasia arctica , but little GS variation in the highly selfing Euphrasia micrantha . Interspecific differences in GS genomic repeat percentages were small. We show the utility of treating GS as the outcome of polygenic variation. Like other types of genetic variation, such as single nucleotide polymorphisms, GS variation may be increased through hybridisation and population subdivision. In addition to selection on associated traits, GS is predicted to be affected indirectly by selection due to pleiotropy of the underlying PAVs.

Abstract Understanding hybridization and introgression between natural plant populations can give important insights into the origins of cultivated species. Recent studies suggest differences in ploidy may not create such strong reproductive barriers as once thought, and thus studies into cultivated origins should examine all co-occurring taxa, including those with contrasting ploidy levels. Here, we characterized hybridization between Chrysanthemum indicum, Chrysanthemum vestitum and Chrysanthemum vestitum var. latifolium , the most important wild species involved in the origins of cultivated chrysanthemums. We analysed population structure of 317 Chrysanthemum accessions based on 13 microsatellite markers and sequenced chloroplast trn L- trn F for a subset of 103 Chrysanthemum accessions. We identified three distinct genetic clusters, corresponding to the three taxa. We detected 20 hybrids between species of different ploidy levels, of which 19 were between C. indicum (4x) and C. vestitum (6x) and one was between C. indicum and C. vestitum var. latifolium (6x). Fourteen hybrids between C. indicum and C. vestitum were from one of the five study sites. Chrysanthemum vestitum and C. vestitum var. latifolium share only one chloroplast haplotype. The substantially different number of hybrids between hybridizing species was likely due to different levels of reproductive isolation coupled with environmental selection against hybrids. In addition, human activities may play a role in the different patterns of hybridization among populations.

Evolutionary radiations underlie much of the species diversity of life on Earth, particularly within the world9s most species-rich tree flora - that of the Amazon rainforest. Hybridisation catalyses many radiations by generating genetic and phenotypic novelty that promote rapid speciation, but the influence of hybridisation on Amazonian tree radiations has been little studied. We address this using the ubiquitous, species-rich neotropical tree genus Inga, which typifies rapid radiations of rainforest trees. We assess patterns of gene tree incongruence to ascertain whether hybridisation catalysed rapid radiation in Inga. Given the importance of insect herbivory in structuring rainforest tree communities (and hence the potential for hybridisation to promote adaptation through admixture of defence traits), we also test whether introgression of loci underlying chemical defences against herbivory facilitated rapid speciation in Inga. Our phylogenomic analyses of 189/288 Inga species using >1300 target capture loci showed widespread introgression in Inga and closely related genera. Specifically, we found widespread phylogenetic incongruence explained by introgression, with phylogenetic networks recovering multiple introgression events across Inga and related genera. In addition, most defence chemistry loci showed evidence of positive selection and marginally higher levels of introgression. Interestingly, we recovered around 20% admixed variation between multiple Inga species, a similar proportion to that found in other radiations catalysed by 9ancient9 hybridisation. Overall our results suggest that introgression has occurred widely over the course of Inga9s history, likely facilitated by extensive dispersal across Amazonia, and that in some cases introgression of chemical defence loci may facilitate adaptation in Inga.

Abstract Genome size variation within plant (and other) taxa may be due to presence/absence variation in low-copy sequences or copy number variation in genomic repeats of various frequency classes. However, identifying the sequences underpinning genome size variation has been challenging because genome assemblies commonly contain collapsed representations of repetitive sequences and because genome skimming studies miss low-copy number sequences. Here, we take a novel approach based on k-mers, short sub-sequences of equal length k , generated from whole genome sequencing data of diploid eyebrights ( Euphrasia ), a group of plants which have considerable genome size variation within a ploidy level. We compare k-mer inventories within and between closely related species, and quantify the contribution of different copy number classes to genome size differences. We further assign high-copy number k-mers to specific repeat types as retrieved from the RepeatExplorer2 pipeline. We find complex patterns of k-mer differences between samples. While all copy number classes contributed to genome size variation, the largest contribution came from repeats with 1000-10,000 genomic copies including the 45S rDNA satellite DNA and, unexpectedly, a repeat associated with an Angela transposable element. We also find size differences in the low-copy number class, likely indicating differences in gene space between our samples. In this study, we demonstrate that it is possible to pinpoint the sequences causing genome size variation within species without use of a reference genome. Such sequences can serve as targets for future cytogenetic studies. We also show that studies of genome size variation should go beyond repeats and consider the whole genome. To allow future work with other taxonomic groups, we share our analysis pipeline, which is straightforward to run, relying largely on standard GNU command line tools.