Summary Individuals with autism spectrum disorders (ASD) exhibit an increased burden of de novo variants in a broadening range of genes. We functionally tested the effects of ASD missense variants using Drosophila through ‘humanization’ rescue and overexpression-based strategies. We studied 79 ASD variants in 74 genes identified in the Simons Simplex Collection and found 38% of them caused functional alterations. Moreover, we identified GLRA2 as the cause of a spectrum of neurodevelopmental phenotypes beyond ASD in eight previously undiagnosed subjects. Functional characterization of variants in ASD candidate genes point to conserved neurobiological mechanisms and facilitates gene discovery for rare neurodevelopmental diseases.

Abstract Background Non-coding regulatory elements (NCREs), such as enhancers, play a crucial role in gene regulation and genetic aberrations in NCREs can lead to human disease, including brain disorders. The human brain is complex and can be affected by numerous disorders; many of these are caused by genetic changes, but a multitude remain currently unexplained. Understanding NCREs acting during brain development has the potential to shed light on previously unrecognised genetic causes of human brain disease. Despite immense community-wide efforts to understand the role of the non-coding genome and NCREs, annotating functional NCREs remains challenging. Results Here we performed an integrative computational analysis of virtually all currently available epigenome data sets related to human fetal brain. Our in-depth analysis unravels 39,709 differentially active enhancers (DAEs) that show dynamic epigenomic rearrangement during early stages of human brain development, indicating likely biological function. Many of these DAEs are linked to clinically relevant genes, and functional validation of selected DAEs in cell models and zebrafish confirms their role in gene regulation. Compared to enhancers without dynamic epigenomic rearrangement, these regions are subjected to higher sequence constraints in humans, have distinct sequence characteristics and are bound by a distinct transcription factor landscape. DAEs are enriched for GWAS loci for brain related traits and for genetic variation found in individuals with neurodevelopmental disorders, including autism. Conclusion Our compendium of high-confidence enhancers will assist in deciphering the mechanism behind developmental genetics of the human brain and will be relevant to uncover missing heritability in human genetic brain disorders.

Abstract ANK3 encodes ankyrin‐G, a protein involved in neuronal development and signaling. Alternative splicing gives rise to three ankyrin‐G isoforms comprising different domains with distinct expression patterns. Mono‐ or biallelic ANK3 variants are associated with non‐specific syndromic intellectual disability in 14 individuals (seven with monoallelic and seven with biallelic variants). In this study, we describe the clinical features of 13 additional individuals and review the data on a total of 27 individuals (16 individuals with monoallelic and 11 with biallelic ANK3 variants) and demonstrate that the phenotype for biallelic variants is more severe. The phenotypic features include language delay (92%), autism spectrum disorder (76%), intellectual disability (78%), hypotonia (65%), motor delay (68%), attention deficit disorder (ADD) or attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) (57%), sleep disturbances (50%), aggressivity/self‐injury (37.5%), and epilepsy (35%). A notable phenotypic difference was presence of ataxia in three individuals with biallelic variants, but in none of the individuals with monoallelic variants. While the majority of the monoallelic variants are predicted to result in a truncated protein, biallelic variants are almost exclusively missense. Moreover, mono‐ and biallelic variants appear to be localized differently across the three different ankyrin‐G isoforms, suggesting isoform‐specific pathological mechanisms.

ABSTRACT Pathogenic variants in SETD1B have been associated with a syndromic neurodevelopmental disorder including intellectual disability, language delay and seizures. To date, clinical features have been described for eleven patients with (likely) pathogenic SETD1B sequence variants. We perform an in-depth clinical characterization of a cohort of 36 unpublished individuals with SETD1B sequence variants, describing their molecular and phenotypic spectrum. Selected variants were functionally tested using in vitro and genome-wide methylation assays. Our data present evidence for a loss-of-function mechanism of SETD1B variants, resulting in a core clinical phenotype of global developmental delay, language delay including regression, intellectual disability, autism and other behavioral issues, and variable epilepsy phenotypes. Developmental delay appeared to precede seizure onset, suggesting SETD1B dysfunction impacts physiological neurodevelopment even in the absence of epileptic activity. Interestingly, males are significantly overrepresented and more severely affected, and we speculate that sex-linked traits could affect susceptibility to penetrance and the clinical spectrum of SETD1B variants. Finally, despite the possibility of non-redundant contributions of SETD1B and its paralogue SETD1A to epigenetic control, the clinical phenotypes of the related disorders share many similarities, indicating that elucidating shared and divergent downstream targets of both genes will help to understand the mechanism leading to the neurobehavioral phenotypes. Insights from this extensive cohort will facilitate the counseling regarding the molecular and phenotypic landscape of newly diagnosed patients with the SETD1B -related syndrome.

In humans and other mammals, female cells carry two X-chromosomes, whereas male cells carry a single X and Y-chromosome. To achieve an equal expression level of X-linked genes in both sexes, a dosage compensation mechanism evolved, which results in transcriptional silencing of one X-chromosome in females. X chromosome inactivation (XCI) is random with respect to the parental origin of the X, occurs early during embryonic development, and is then stably maintained through a near infinite number of cell divisions. As a result of this, every female individual consists of a mosaic of two different cell populations, in which either the maternally or paternally derived X-chromosome is inactivated. As the X-chromosome harbors more than a thousand genes, of which many are implicated in human disease when mutated, this mosaicism has important disease implications. Whereas X-linked disorders are usually more severe in hemizygous males harboring a single X-chromosome, a more variable phenotype is observed in females. This variability is a direct consequence of the XCI-mosaicism, and is affected by the randomness of the XCI process. Here we review the latest insights into the regulation of this important female specific process, and discuss mechanisms that influence mosaicism in females, with a focus on the clinical consequences related to X-linked diseases in females.

Abstract Hirschsprung disease (HSCR) is caused by an absence of the enteric nervous system (ENS), which is crucial for intestinal function. The ENS is composed of enteric neurons and glia, and is mostly derived from migrating vagal neural crest cells. Trunk-derived Schwann cells also play a significant role in postnatal maintenance of the ENS. However, the diversity of the ENS in health and disease remains largely unknown. Here, we performed single cell RNA sequencing on pediatric controls and HSCR individuals, and identified two major classes of enteric glia, being canonical and Schwann-like enteric glia. We show that the latter are the main contributors of enteric glia heterogeneity after birth and importantly, that they are preserved in aganglionic segments of HSCR individuals. In a zebrafish model of HSCR, which also shows preservation of Schwann-like enteric glia, enteric neurogenesis could be stimulated, demonstrating a potential novel therapy for HSCR.

ABSTRACT Pathogenic variants in the ubiquitin-specific protease 7 ( USP7 ) gene cause a neurodevelopmental disorder called Hao-Fountain syndrome. However, which of USP7’s pleiotropic functions are relevant for neurodevelopment remains unclear. Here, we present a combination of quantitative proteomics, transcriptomics and epigenomics to define the USP7 regulatory circuitry during neuronal differentiation. USP7 activity is required for the transcriptional programs that direct both differentiation of embryonic stem cells into neural stem cells, and the neuronal differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells. USP7 controls the dosage of the Polycomb H2AK119ub1 ubiquitin ligase complexes ncPRC1.1 and ncPRC1.6. Loss-of-function experiments revealed that BCOR-ncPRC1.1, but not ncPRC1.6, is a key effector of USP7 during neuronal differentiation. Indeed, BCOR-ncPRC1.1 mediates most of USP7-dependent gene regulation during this process. Besides providing a detailed map of the USP7 regulome during neurodifferentiation, our results suggest that USP7 and ncPRC1.1-associated neurodevelopmental disorders involve dysregulation of a shared epigenetic network.

Embryos from different mammalian species develop at characteristic timescales. These timescales are recapitulated during the differentiation of pluripotent stem cells in vitro. Specific genes and molecular pathways that modulate cell differentiation speed between mammalian species remain to be determined. Here we use single-cell multi-omic analysis of neural differentiation of mouse, cynomolgus and human pluripotent cells to identify regulators for differentiation speed. We demonstrate that species-specific transcriptome dynamics are mirrored at the chromatin level, but that the speed of neural differentiation is insensitive to manipulations of cell growth and cycling. Exploiting the single-cell resolution of our data, we identify glycogen storage levels regulated by UDP-glucose pyrophosphorylase 2 (UGP2) as a species-dependent trait of pluripotent cells, and show that lowered glycogen storage in UGP2 mutant cells is associated with accelerated neural differentiation. The control of energy storage could be a general strategy for the regulation of cell differentiation speed.

Summary HIV-1 latency results from tightly regulated molecular processes that act at distinct steps of HIV-1 gene expression. To elucidate the molecular players that govern latency, we previously performed a dCas9-chromatin immunoprecipitation coupled with mass spectrometry (Catchet-MS) and identified the interactome of the latent HIV-1 LTR. Here we characterize the Catchet-MS-identified PCI domain-containing 2 (PCID2) protein, a component of the TREX2 complex, to play a dual role in promoting HIV-1 latency by enforcing both transcriptional repression and post-transcriptional blocks to HIV-1 gene expression. PCID2 bound the latent HIV-1 LTR and repressed transcription initiation during latency. Depletion of PCID2 remodelled the chromatin landscape at the HIV-1 promoter and resulted in transcriptional activation and reversal of latency. Immunoprecipitation coupled to Mass Spectrometry identified PCID2-interacting proteins to include members of the spliceosome, including negative viral RNA (vRNA) alternative splicing regulators, and PCID2 depletion resulted in over-splicing of intron-containing vRNA and misregulated expression of vRNA splice variants. We demonstrate that MCM3AP and DSS1, two other RNA-binding TREX2 complex subunits that comprise the dock of the complex also inhibit transcription initiation and viral RNA alternative splicing during latency and similarly to PCID2 function as prominent latency associated repressors of HIV-1 gene expression. Thus, PCID2 is a novel HIV-1 latency-promoting factor, which in context of the TREX2 sub-complex PCID2-DSS1-MCM3AP blocks transcription and dysregulates vRNA processing.

Embryonic stem cells (ESCs) can differentiate into all cell types of the embryonic germ layers. ESCs can also generate totipotent 2C-like cells and trophectodermal cells. However, these latter transitions occur at low frequency due to epigenetic barriers, the nature of which is not fully understood. Here, we show that treating mouse ESCs with sodium butyrate (NaB) increases the population of 2C-like cells and enables direct reprogramming of ESCs into trophoblast stem cells (TSCs) without a transition through a 2C-like state. Mechanistically, NaB inhibits histone deacetylase activities in the LSD1-HDAC1/2 corepressor complex. This increases acetylation levels in the regulatory regions of both 2C- and TSC-specific genes, promoting their expression. In addition, NaB-treated cells acquire the capacity to generate blastocyst-like structures that can develop beyond the implantation stage in vitro and form deciduae in vivo. These results identify how epigenetics restrict the totipotent and trophectoderm fate in mouse ESCs.