Unstable transcripts have emerged as markers of active enhancers in vertebrates and shown to be involved in many cellular processes and medical disorders. However, their prevalence and role in plants is largely unexplored. Here, we comprehensively captured all actively initiating ("nascent") transcripts across diverse crops and other plants using capped small (cs)RNA-seq. We discovered that unstable transcripts are rare, unlike in vertebrates, and often originate from promoters. Additionally, many "distal" elements in plants initiate tissue-specific stable transcripts and are likely bone fide promoters of yet-unannotated genes or non-coding RNAs, cautioning against using genome annotations to infer "enhancers" or transcript stability. To investigate enhancer function, we integrated STARR-seq data. We found that annotated promoters, and other regions that initiate stable transcripts rather than unstable transcripts, function as stronger enhancers in plants. Our findings underscore the blurred line between promoters and enhancers and suggest that cis-regulatory elements encompass diverse structures and mechanisms in eukaryotes.

Abstract Unstable transcripts have emerged as markers of active enhancers in vertebrates and shown to be involved in many cellular processes and medical disorders. However, their prevalence and role in plants is largely unexplored. Here, we comprehensively captured all actively initiating (nascent) transcripts across diverse crops and other plants using capped small (cs)RNA sequencing. We discovered that unstable transcripts are rare in plants, unlike in vertebrates, and when present, often originate from promoters. In addition, many ‘distal’ elements in plants initiate tissue-specific stable transcripts and are likely bona fide promoters of as-yet-unannotated genes or non-coding RNAs, cautioning against using reference genome annotations to infer putative enhancer sites. To investigate enhancer function, we integrated data from self-transcribing active regulatory region (STARR) sequencing. We found that annotated promoters and other regions that initiate stable transcripts, but not those marked by unstable or bidirectional unstable transcripts, showed stronger enhancer activity in this assay. Our findings underscore the blurred line between promoters and enhancers and suggest that cis -regulatory elements can encompass diverse structures and mechanisms in eukaryotes, including humans.

ABSTRACT Next-Generation Sequencing (NGS) catalyzed breakthroughs across various scientific domains. Illumina’s sequencing by synthesis method has long been essential for NGS but emerging technologies like Element Biosciences’ sequencing by avidity (AVITI) represent a novel approach. It has been reported that AVITI offers improved signal-to-noise ratios and cost reductions. However, the method relies on rolling circle amplification which can be impacted by polymer size, raising questions about its efficacy sequencing small RNAs (sRNA) molecules including microRNAs (miRNAs), piwi-interacting RNAs (piRNAs), and others that are crucial regulators of gene expression and involved in various biological processes. In addition, capturing capped small RNAs (csRNA-seq) has emerged as a powerful method to map active or “nascent” RNA polymerase II transcription initiation in tissues and clinical samples. Here, we report a new protocol for seamlessly sequencing short DNA fragments on the AVITI and demonstrate that AVITI and Illumina sequencing technologies equivalently capture human, cattle ( Bos taurus ) and the bison ( Bison bison ) sRNA or csRNA sequencing libraries, augmenting the confidence in both approaches. Additionally, analysis of generated nascent transcription start sites (TSSs) data for cattle and bison revealed inaccuracies in their current genome annotations and highlighted the possibility and need to translate small RNA sequencing methodologies to livestock. Our accelerated and optimized protocol therefore bridges the advantages of AVITI sequencing and critical methods that rely on sequencing short DNA fragments.

Abstract Background Next-Generation Sequencing (NGS) catalyzed breakthroughs across various scientific domains. Illumina’s sequencing by synthesis method has long been central to NGS, but new sequencing methods like Element Biosciences’ AVITI technology are emerging. AVITI is reported to offer improved signal-to-noise ratios and cost reductions. However, its reliance on rolling circle amplification, which can be affected by polymer size, raises questions about its effectiveness in sequencing small RNAs (sRNAs) such as microRNAs (miRNAs), small nucleolar RNAs (snoRNAs), and many others. These sRNAs are crucial regulators of gene expression and involved in various biological processes. Additionally, capturing capped small RNAs (csRNA-seq) is a powerful method for mapping active or “nascent” RNA polymerase II transcription initiation in tissues and clinical samples. Results Here, we report a new protocol for seamlessly sequencing short fragments on the AVITI and demonstrate that AVITI and Illumina sequencing technologies equivalently capture human, cattle ( Bos taurus ), and bison ( Bison bison ) sRNA or csRNA sequencing libraries, increasing confidence in both sequencing approaches. Additionally, analysis of generated nascent transcription start site (TSS) data for cattle and bison revealed inaccuracies in their current genome annotations, underscoring the potential and necessity to translate small and nascent RNA sequencing methodologies to livestock. Conclusions Our accelerated and optimized protocol bridges the advantages of AVITI sequencing with critical methods that rely on sequencing short fragments. This advance bolsters the utility of AVITI technology alongside traditional Illumina platforms, offering new opportunities for NGS applications.