Abstract Recent neuroscientific research seeks to comprehend the sophisticated deep-brain networks of neural circuits consisting of large scale neuronal ensembles across multiple brain regions. An ideal way to unveil the complex connectome might be stimulating individual neurons with high spatial resolution in a broad range of brain, while seamlessly monitoring the correspondent neuronal activities. Optogenetics is known as a key technology to enable such a goal thanks to its high spatial and temporal selectivity in neuromodulation. Existing silicon probe technologies have been able to partially achieve such a goal by recording broad region of brain activities through multiple electrodes per shank, but those cannot complete perfect coverage due to the limited channel counts for the optogenetic stimulation. Here, we present an high-channel-count optogenetic system with simultaneous 256 recoding and 128 optogenetic stimulation sites, exhibiting the highest channel density ever reported, enabled by a flexible polyimide cable-based hybrid-integration of a low-stimulation-artifact micro-LED (µLED) opto-electrode with a low-power and -noise, area-efficient CMOS interfacing integrated-circuit (IC). The presented optogenetic system provides 256-neuron-size electrodes (11 × 15 µm 2 ) with a 40 µm inter-electrode pitch for high spatial oversampling in recording and 128-soma-size µLEDs (8 × 11 µm 2 ) with a 20 µm inter-LED pitch for single-cell resolution in stimulation, resulting in a vertical span of 640 µm and a horizontal span of 2,100 µm with a total 8 shanks. For versatility in optogenetics-based experiments from small rodents to primates with user-preferable settings, the system base that provides programmability of recording and stimulation parameters and rest of signal processing, such as filtering, digitization, and data transmission including serial peripheral interface (SPI) has also been designed within small area of 23.8 × 28.8 mm 2 with only 3.5-gram weight, resulting in the highest channel density both in size (0.56 channels/mm 2 ) and weight (109.71 channels/gram) among the state-of-the-art optogenetics-based neuromodulation systems. To verify the system operation in vivo , a compact optogenetics headstage has been also fabricated. Using the prepared optogenetic headstage, 169 isolated neurons have been observed with various stimulation intensities. The results offered in this article indicate that the presented hybrid integrated ultrahigh-density, high-channel-count headstage can be used to realize the massive-scale in-depth brain studies with optogenetics.

Optogenetics are a powerful tool for testing how a neural circuit influences neural activity, cognition, and behavior. Accordingly, the number of studies employing optogenetic perturbation has grown exponentially over the last decade. However, recent studies have highlighted that the impact of optogenetic stimulation/silencing can vary depending on the construct used, the local microcircuit connectivity, extent/power of illumination, and neuron types perturbed. Despite these caveats, the majority of studies employ optogenetics without simultaneously recording neural activity in the circuit that is being perturbed. This dearth of simultaneously recorded neural data is due in part to technical difficulties in combining optogenetics and extracellular electrophysiology. The recent introduction of μLED silicon probes, which feature independently controllable miniature LEDs embedded at several levels of each of multiple shanks of silicon probes, provides a tractable method for temporally and spatially precise interrogation of neural circuits. Here, we provide a protocol addressing how to perform chronic recordings using μLED probes. This protocol provides a schematic for performing causal and reproducible interrogations of neural circuits and addresses all phases of the recording process: introduction of optogenetic construct, implantation of the μLED probe, performing simultaneous optogenetics and electrophysiology