Abstract Retinoic acid-inducible gene I ( RIG-I ) activates mitochondrial antiviral signaling proteins, initiating the antiviral response. RIG-I and RNF135 , a ubiquitin ligase regulator, are missing in domestic chickens but conserved in mallard ducks. It was long believed that chickens’ RIG-I loss was linked to increased avian influenza susceptibility. We reinstated both genes in chickens and examined their susceptibility to the avian influenza virus H7N1. Uninfected RIG-I -expressing chickens exhibited shifts in T and B cells, while the H7N1 infection led to severe disease, persistent weight loss, and increased viral replication. Conversely, the co-expression of RIG-I and RNF135 reduced the viral replication and was associated with high inflammatory response. Our data indicate that the loss of RIG-I in chickens likely evolved to counteract deleterious inflammation caused by viral infection. We highlight the effects of restoring evolutionary lost genes in birds and suggest a new immunological approach to reduce viral replication and prevent infection. Graphical abstract

Genetically modified animals continue to provide important insights in biomedical sciences. Research has focused mostly on genetically modified mice so far, but other species like pigs resemble more closely the human physiology. In addition, cross-species comparisons with phylogenetically distant species such as chickens provide powerful insights into fundamental biological and biomedical processes. One of the most versatile genetic methods applicable across species is CRISPR/Cas9. Here, we report for the first time the generation of Cas9 transgenic chickens and pigs that allow in vivo genome editing in these two important agricultural species. We demonstrated that Cas9 is constitutively expressed in all organs of both species and that the animals are healthy and fertile. In addition, we confirmed the functionality of Cas9 for a number of different target genes and for a variety of cell types. Taken together, these transgenic animal species expressing Cas9 provide an unprecedented tool for agricultural and biomedical research, and will facilitate organ specific reverse genetics as well as cross-species comparisons.

Abstract The availability of genetically modified mice has facilitated the study of mammalian T cells. No model has yet been developed to study these cells in chicken, an important livestock species with a high availability of γδ T cells. To investigate the role of γδ and αβ T cell populations in birds, we generated chickens lacking these T cell populations. This was achieved by genomic deletion of the constant region of the T cell receptor γ or αβ chain, leading to a complete loss of either γδ or αβ T cells. Our results show that a deletion of αβ T cells but not γδ T cells resulted in a severe phenotype in knockout chickens. The αβ T cell knockout chickens exhibited granulomas associated with inflammation of the spleen and the proventriculus. Immunophenotyping of αβ T cell knockout chickens revealed a significant increase in monocytes and the absence of CD4 + T cells and FoxP3 + regulatory T cells compared to wild type chickens. In addition, we observed a significant decrease in immunoglobulins, B lymphocytes, and changes in the bursa morphology. Our data reveal the consequences of T cell knockouts in chickens and provide new insights into their function in vertebrates. Significance statement The lack of genetically modified chickens has severely limited research in avian immunology compared to other animal models. Here, we report the generation of two T cell knockout chicken lines that will contribute significantly to the understanding of T cell biology as a very important research model as well as an important livestock species. The generated animals reveal the function of different T cell populations in chickens and will help to better understand the role of these cells during the interaction with various pathogens in birds.