Summary

 DNA methylation is a covalent biochemical modification controlling chromatin structure and gene expression. Exercise elicits gene expression changes that trigger structural and metabolic adaptations in skeletal muscle. We determined whether DNA methylation plays a role in exercise-induced gene expression. Whole genome methylation was decreased in skeletal muscle biopsies obtained from healthy sedentary men and women after acute exercise. Exercise induced a dose-dependent expression of PGC-1α, PDK4, and PPAR-δ, together with a marked hypomethylation on each respective promoter. Similarly, promoter methylation of PGC-1α, PDK4, and PPAR-δ was markedly decreased in mouse soleus muscles 45 min after ex vivo contraction. In L6 myotubes, caffeine exposure induced gene hypomethylation in parallel with an increase in the respective mRNA content. Collectively, our results provide evidence that acute gene activation is associated with a dynamic change in DNA methylation in skeletal muscle and suggest that DNA hypomethylation is an early event in contraction-induced gene activation.

An association mapping study of type-2-diabetes-related quantitative traits in the Greenlandic population identified a common variant in TBC1D4 that increases plasma glucose levels and serum insulin levels after an oral glucose load and type 2 diabetes risk, with effect sizes several times larger than any previous findings of large-scale genome-wide association studies for these traits. This systematic genetic association study of quantitative traits related to type 2 diabetes (T2D) has identified a nonsense variant in the gene TBC1D4 which is present in 17% of the Greenlandic population, known to be a small founder population with a high incidence of T2D. The gene variant increases the levels of plasma glucose, serum insulin, and dramatically increases T2D risk. It also modestly reduces the concentrations of fasting plasma and fasting serum insulin. This work illustrates the value of founder populations — or of small and historically isolated populations — in maximizing the effectiveness of genetic association studies of this type. The Greenlandic population, a small and historically isolated founder population comprising about 57,000 inhabitants, has experienced a dramatic increase in type 2 diabetes (T2D) prevalence during the past 25 years1. Motivated by this, we performed association mapping of T2D-related quantitative traits in up to 2,575 Greenlandic individuals without known diabetes. Using array-based genotyping and exome sequencing, we discovered a nonsense p.Arg684Ter variant (in which arginine is replaced by a termination codon) in the gene TBC1D4 with an allele frequency of 17%. Here we show that homozygous carriers of this variant have markedly higher concentrations of plasma glucose (β = 3.8 mmol l−1, P = 2.5 × 10−35) and serum insulin (β = 165 pmol l−1, P = 1.5 × 10−20) 2 hours after an oral glucose load compared with individuals with other genotypes (both non-carriers and heterozygous carriers). Furthermore, homozygous carriers have marginally lower concentrations of fasting plasma glucose (β = −0.18 mmol l−1, P = 1.1 × 10−6) and fasting serum insulin (β = −8.3 pmol l−1, P = 0.0014), and their T2D risk is markedly increased (odds ratio (OR) = 10.3, P = 1.6 × 10−24). Heterozygous carriers have a moderately higher plasma glucose concentration 2 hours after an oral glucose load than non-carriers (β = 0.43 mmol l−1, P = 5.3 × 10−5). Analyses of skeletal muscle biopsies showed lower messenger RNA and protein levels of the long isoform of TBC1D4, and lower muscle protein levels of the glucose transporter GLUT4, with increasing number of p.Arg684Ter alleles. These findings are concomitant with a severely decreased insulin-stimulated glucose uptake in muscle, leading to postprandial hyperglycaemia, impaired glucose tolerance and T2D. The observed effect sizes are several times larger than any previous findings in large-scale genome-wide association studies of these traits2,3,4 and constitute further proof of the value of conducting genetic association studies outside the traditional setting of large homogeneous populations.

Skeletal muscle constitutes 40% of individual body mass and plays vital roles in locomotion and whole-body metabolism. Proteomics of skeletal muscle is challenging because of highly abundant contractile proteins that interfere with detection of regulatory proteins. Using a state-of-the art MS workflow and a strategy to map identifications from the C2C12 cell line model to tissues, we identified a total of 10,218 proteins, including skeletal muscle specific transcription factors like myod1 and myogenin and circadian clock proteins. We obtain absolute abundances for proteins expressed in a muscle cell line and skeletal muscle, which should serve as a valuable resource. Quantitation of protein isoforms of glucose uptake signaling pathways and in glucose and lipid metabolic pathways provides a detailed metabolic map of the cell line compared with tissue. This revealed unexpectedly complex regulation of AMP-activated protein kinase and insulin signaling in muscle tissue at the level of enzyme isoforms. Skeletal muscle constitutes 40% of individual body mass and plays vital roles in locomotion and whole-body metabolism. Proteomics of skeletal muscle is challenging because of highly abundant contractile proteins that interfere with detection of regulatory proteins. Using a state-of-the art MS workflow and a strategy to map identifications from the C2C12 cell line model to tissues, we identified a total of 10,218 proteins, including skeletal muscle specific transcription factors like myod1 and myogenin and circadian clock proteins. We obtain absolute abundances for proteins expressed in a muscle cell line and skeletal muscle, which should serve as a valuable resource. Quantitation of protein isoforms of glucose uptake signaling pathways and in glucose and lipid metabolic pathways provides a detailed metabolic map of the cell line compared with tissue. This revealed unexpectedly complex regulation of AMP-activated protein kinase and insulin signaling in muscle tissue at the level of enzyme isoforms. Skeletal muscle is a highly specialized tissue that plays a fundamental role in locomotion and is indispensable in regulating whole-body carbohydrate metabolism. This tissue alone accounts for about 75% of insulin-stimulated glucose uptake (1DeFronzo R.A. Gunnarsson R. Bjorkman O. Olsson M. Wahren J. Effects of insulin on peripheral and splanchnic glucose metabolism in noninsulin-dependent (type II) diabetes mellitus.J. Clin. Invest. 1985; 76: 149-155Crossref PubMed Scopus (885) Google Scholar). Skeletal muscle exhibits a remarkable plasticity and adapts to a wide range of stimuli such as exercise and nutrient supply (2Chibalin A.V. Yu M. Ryder J.W. Song X.M. Galuska D. Krook A. Wallberg-Henriksson H. Zierath J.R. Exercise-induced changes in expression and activity of proteins involved in insulin signal transduction in skeletal muscle: differential effects on insulin-receptor substrates 1 and 2.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000; 97: 38-43Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar, 3Booth F.W. Thomason D.B. Molecular and cellular adaptation of muscle in response to exercise: perspectives of various models.Physiol. Rev. 1991; 71: 541-585Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar, 4Hawley J.A. Adaptations of skeletal muscle to prolonged, intense endurance training.Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2002; 29: 218-222Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar). Metabolism and function of skeletal muscle is severely affected in pathological conditions such as type 2 diabetes (5DeFronzo R.A. Bonadonna R.C. Ferrannini E. Pathogenesis of NIDDM. A balanced overview.Diabetes Care. 1992; 15: 318-368Crossref PubMed Scopus (1891) Google Scholar), neuromuscular disorders (6Lacomis D. Electrophysiology of neuromuscular disorders in critical illness.Muscle Nerve. 2013; 47: 452-463Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar), cancer cachexia (7Kadar L. Albertsson M. Areberg J. Landberg T. Mattsson S. The prognostic value of body protein in patients with lung cancer.Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000; 904: 584-591Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), age-related sarcopenia (8Evans W.J. What is sarcopenia?.J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 1995; 50: 5-8Crossref PubMed Google Scholar), muscular atrophy (9Mallinson J.E. Murton A.J. Mechanisms responsible for disuse muscle atrophy: potential role of protein provision and exercise as countermeasures.Nutrition. 2013; 29: 22-28Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar), and muscular dystrophy (10Campbell K.P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage.Cell. 1995; 80: 675-679Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (759) Google Scholar). MS-based proteomics has begun to advance molecular understanding of these muscle diseases (11Hojlund K. Yi Z. Hwang H. Bowen B. Lefort N. Flynn C.R. Langlais P. Weintraub S.T. Mandarino L.J. Characterization of the human skeletal muscle proteome by one-dimensional gel electrophoresis and HPLC-ESI-MS/MS.Mol. Cell. Proteomics. 2008; 7: 257-267Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar, 12Doran P. Yi Z. Hwang H. Bowen B. Lefort N. Flynn C.R. Langlais P. Weintraub S.T. Mandarino L.J. Proteome analysis of the dystrophin-deficient MDX diaphragm reveals a drastic increase in the heat shock protein cvHSP.Proteomics. 2006; 6: 4610-4621Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 13Parker K.C. Walsh R.J. Salajegheh M. Amato A.A. Krastins B. Sarracino D.A. Greenberg S.A. Characterization of human skeletal muscle biopsy samples using shotgun proteomics.J. Proteome Res. 2009; 8: 3265-3277Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). However, most of these pioneering studies had limited proteome coverage and lacked robust quantitation (14Ohlendieck K. Proteomics of skeletal muscle differentiation, neuromuscular disorders, and fiber aging.Expert Rev. Proteomics. 2010; 7: 283-296Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Significant technological advances over the last decade now allow near exhaustive analysis of cell line proteomes (15Nagaraj N. Wisniewski J.R. Geiger T. Cox J. Kircher M. Kelso J. Paabo S. Mann M. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 548Crossref PubMed Scopus (750) Google Scholar, 16Beck M. Schmidt A. Malmstroem J. Claassen M. Ori A. Szymborska A. Herzog F. Rinner O. Ellenberg J. Aebersold R. The quantitative proteome of a human cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 549Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar, 17Altelaar A.F. Munoz J. Heck A.J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.Nat Rev Genet. 2013; 14: 35-48Crossref PubMed Scopus (521) Google Scholar). These advances have recently enabled the identification of several thousand proteins in muscle tissue preparations (18Geiger T. Velic A. Macek B. Lundberg E. Kampf C. Nagaraj N. Uhlen M. Cox J. Mann M. Initial quantitative proteomic map of 28 mouse tissues using the SILAC mouse.Mol. Cell. Proteomics. 2013; 12: 1709-1722Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar, 19Drexler H.C. Ruhs A. Konzer A. Mendler L. Bruckskotten M. Looso M. Gunther S. Boettger T. Kruger M. Braun T. On marathons and sprints: an integrated quantitative proteomics and transcriptomics analysis of differences between slow and fast muscle fibers.Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11 (M111 010801)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). However, the challenging dynamic range of protein expression in tissues in general and in muscle in particular has so far prevented measurement of very deep proteomes that would also cover the low abundance, regulatory proteins. The C2C12 is an immortalized mouse myoblast cell line that can readily be differentiated to myotubes in culture and is commonly used as a model system for investigating molecular, biochemical, or pathological changes of skeletal muscle (20Tsuchiya Y. Hatakeyama H. Emoto N. Wagatsuma F. Matsushita S. Kanzaki M. Palmitate-induced down-regulation of sortilin and impaired GLUT4 trafficking in C2C12 myotubes.J. Biol. Chem. 2010; 285: 34371-34381Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (60) Google Scholar, 21Sharples A.P. Al-Shanti N. Stewart C.E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and aging?.J. Cell. Physiol. 2010; 225: 240-250Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 22Watanabe T. Sasagawa N. Usuki F. Koike H. Saitoh N. Sorimachi H. Maruyama K. Nakase H. Takagi A. Ishiura S. Suzuki K. Overexpression of myotonic dystrophy protein kinase in C2C12 myogenic culture involved in the expression of ferritin heavy chain and interleukin-1alpha mRNAs.J. Neurol. Sci. 1999; 167: 26-33Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4) Google Scholar). Although these cells express sarcomeric proteins and can develop contractile properties in culture, they lack the 3D structure and specialized muscle functions characteristic of the tissue context. Here we measured a very deep proteome of the C2C12 myotubes and transfer the peptide and protein identifications to a data set obtained under the same conditions from adult mouse skeletal muscle. This strategy allowed us to obtain the largest skeletal muscle proteome so far and to highlight similarities and differences between these two model systems. We further quantitatively mapped the protein isoforms of glucose uptake signaling pathways, key metabolic pathways, and muscle specific transcription factors. Although we choose to present quantitation of these selected proteins and pathways because of their central role in muscle function, our approach could be applied to any protein or pathway as well as expanded to other challenging tissues. All animal experiments were approved by Danish Animal Experimental Inspectorate in compliance with the European Convention for Protection of Vertebrate Animal Used for Scientific Purposes. Fifteen-week-old female C57BL/6 mice were maintained on a 12:12-h light-dark cycle and had free access to standard chow diet. Triceps muscles were surgically removed from the anesthetized mice and quickly frozen in liquid nitrogen followed by storage at −80 °C. C2C12 cells (myoblasts) were grown in Eagle's minimum essential medium supplemented with 2 mm l-glutamine and 10% fetal bovine serum plus antibiotics in a humidified atmosphere with 5% CO2 in air. Undifferentiated myoblasts were grown to confluence in normal growth media (day 0). To induce differentiation, the amount of serum in the media was decreased to 2%. Cells were differentiated for 8 days. Growth medium was replaced with fresh medium every 2 days over a period of 8 days. At day 8 post differentiation, we observed less than 5% cell death (Tryphan blue staining). After 8 days, differentiated C2C12 (myotubes) were harvested for proteomics analysis. Triceps muscle and differentiated C2C12 cells were lysed in buffer consisting of 0.1 m Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 m DTT, and 4% SDS, and incubated at 95 °C for 5 min. Triceps muscle homogenization was achieved with Ultra Turbax blender (IKA, Staufen, Germany). Lysates were sonicated using a Branson type sonicator and were then clarified by centrifugation at 16,100 × g for 10 min. Cell lysates were diluted in 8 m urea in 0.1 m Tris-HCl followed by protein digestion with trypsin according to the FASP 1The abbreviations used are:FDRfalse discovery rateFASPfilter-aided sample preparationHCDHigher-energy collisional dissociation. protocol (23Wisniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 359-362Crossref PubMed Scopus (5042) Google Scholar). After an over-night digestion peptides were eluted from the filters with 25 mm ammonium bicarbonate buffer. From each sample, 100 μg of peptides were fractionated by isoelectric focusing on an OffGel fractionator (Agilent, Santa Clara, USA) in 12 well formats as described (24Hubner N.C. Ren S. Mann M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.Proteomics. 2008; 8: 4862-4872Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Peptides from each of the 12 fractions were purified on C18 StageTips. false discovery rate filter-aided sample preparation Higher-energy collisional dissociation. Analysis was performed in triplicates. Samples were measured using LC-MS instrumentation consisting of an Easy nano-flow HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Odense, Denmark) coupled via a nanoelectrospray ion source (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) to a Q Exactive mass spectrometer (25Michalski A. Damoc E. Hauschild J.P. Lange O. Wieghaus A. Makarov A. Nagaraj N. Cox J. Mann M. Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M111 011015)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar). Purified peptides were separated on 50 cm C18 columns (inner diameter 75 μm, 1.8 μm beads, Dr, Maisch GmbH, Germany). Peptides were loaded onto the column with buffer A (0.5% formic acid) and eluted with a 150 min linear gradient from 2–30% buffer B (80% acetonitrile, 0.5% formic acid). After the gradient the column was washed with 90% buffer B and re-equilibrated with buffer A. Mass spectra were acquired in a data-dependent manner, with automatic switching between MS and MS/MS using a top-10 method. MS spectra were acquired in the Orbitrap analyzer with mass range of 300–1750 m/z and 70,000 resolutions at m/z 200. HCD1 peptide fragments acquired at 25 normalized collision energy were analyzed at high resolution in the Orbitrap. Raw MS files were analyzed by MaxQuant version 1.3.7.4 (26Cox J. Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p. p. b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1367-1372Crossref PubMed Scopus (9150) Google Scholar) (http://www.maxquant.org). MS/MS spectra were searched by the Andromeda search engine (27Cox J. Neuhauser N. Michalski A. Scheltema R.A. Olsen J.V. Mann M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.J. Proteome Res. 2011; 10: 1794-1805Crossref PubMed Scopus (3448) Google Scholar) against the decoy UniProt-mouse database (Version June 2012, 59,345 entries) supplemented with 262 frequently observed contaminants and forward and forward and reverse sequences. In the main Andromeda search precursor mass and fragment mass were identified with an initial mass tolerance of 6 ppm and 20 ppm, respectively. The search included variable modifications of methionine oxidation and N-terminal acetylation, and fixed modification of carbamidomethyl cysteine. Minimal peptide length was set to seven amino acids and a maximum of two mis-cleavages was allowed. When we checked for the occurrence of demidation, we found it to be negligible (supplemental Fig. S6, supplemental Table S9). We therefore did not include it as a variable modification. The false discovery rate (FDR1) was set to 0.01 for peptide and protein identifications. MS runs from skeletal muscle were analyzed with or without the "match between runs" option. For matching, a retention time window of 30 s was selected. In the case of identified peptides that are all shared between two proteins, these were combined and reported as one protein group. Proteins matching to the reverse database were filtered out. For the proteins that were identified with single peptide, detailed information about the MSMS spectrum, peptide sequence, precursor m/z is provided (supplemental Table S8 and supplemental Fig. S5). All bioinformatics analysis was performed with the Perseus software (http://www.perseus-framework.org). Categorical annotation was supplied in form of Gene Ontology (GO) biological process (BP), molecular function (MF), and cellular component (CC), as well as participation in a KEGG pathway. All annotations were extracted from UniProt database. Hierarchical clustering and 2D annotation enrichment were based on label-free quantitation of the samples (28Cox J. Hein M.Y. Luber C.A. Paron I. Nagaraj N. Mann M. MaxLFQ allows accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13: 2513-2526Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2687) Google Scholar). Because of randomness of peptide sampling in shotgun proteomics, quantification will be missing in some samples for each protein. In order to retain sufficiently informative protein expression profiles for bioinformatics analysis, the protein expression data was filtered to have at least two valid abundance values in at least one group (muscle or C2C12). The data was inputed to fill missing abundance values by drawing random numbers from a Gaussian distribution with a standard deviation of 30% in comparison to the standard deviation of measured protein abundances, and one standard deviation downshift of the mean. These parameters have been tuned in order to best simulate the distribution of low abundant proteins. These values are universally applied to nearly all data sets that were generated with the label-free quantitation algorithm. Two sample t test were performed on muscle and C2C12 groups with FDR = 0.05. Hierarchical clustering of significantly different proteins was performed after z-score normalization. We then performed Fisher exact test on particular clusters, testing for enrichment or depletion of any annotation term in the cluster compared with the whole matrix. The specific test used is a two-dimensional version of the nonparametric Mann-Whitney test. Multiple hypothesis testing was controlled by using a Benjamini-Hochberg false discovery rate threshold of 5%. Fisher exact test was performed with an FDR value of 0.04. Categorical annotations are supplied in the form of GOCC, GOMF, GOBP, and KEGG. A two-dimensional two-sample test was performed to find the significant differences between the two-dimensional means of the two protein populations (skeletal muscle and C2C12 myotubes). The nonparametric Mann-Whitney test was used. Multiple hypothesis testing was controlled by using a Benjamini-Hochberg FDR threshold of 5%. For categories that are significant, a two-dimensional difference score was calculated by determining the average rank of the protein abundance belonging to the corresponding annotation category. This average rank was then rescaled to the interval between −1 and 1. A value of 1 in one of the dimensions would mean that all members of this category are the largest values in this dimensions, whereas a value of 0 means that the ranks of the members of the category are distributed in same way as the background proteins having no significant bias toward larger or smaller values. For detailed explanation of the rank and scaling of 2D score between 1 to −1, please refer to (29Cox J. Mann M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.BMC Bioinformatics. 2012; 13: S12Crossref PubMed Scopus (413) Google Scholar). Absolute protein abundance (mass) was calculated as described before (30Wisniewski J.R. Ostasiewicz P. Dus K. Zielinska D.F. Gnad F. Mann M. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.Mol. Syst. Biol. 2012; 8: 611Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Briefly, the mass spectrometric signal of an individual protein was divided by the sum of all proteins. Because the resulting values were small, we multiplied them by 1 million and expressed absolute abundance as part-per-million (ppm) (Figs. 5, 6, and supplemental Table I). In other words, the absolute protein abundance described here is the fractional signal of each protein in relation to the total protein signal and hence is expressed in ppm. Quantifiable proteins in the analysis of skeletal muscle and C2C12 myotubes were defined as those identified at least two times in each group. Error bars in Figures 5, 6, and supplemental Fig. S4 denote standard deviation of median. In Table SI, quantifiable proteins were defined as those identified at least two times in skeletal muscle. The absolute abundances that are provided were calculated for the list of the proteins identified after using "match between runs" (Table SI).Fig. 6A proteomic view of skeletal muscle metabolism. A, Schematic representation of glucose and lipid metabolism in skeletal muscle. B, Summed absolute abundance of glucose transporters (GLUT) and fatty acid transporters (FAT). C, Absolute abundance of glycogen synthase (Gys), glycogen phosphorylase (Pyg) and glycogen synthase kinase 3 (Gsk3). D, Total abundance (%) of metabolic pathways. Total abundance is calculated by summing up absolute abundance of individual enzyme from respective pathways (supplemental Table S6). E and F, Percent contribution abundance of contractile proteins, metabolic pathways and other process in skeletal muscle and C2C12 myotubes. Error bars are standard deviation of median.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The lysates from the muscle and C2C12 cells were electrophoresed, transferred to nitrocellulose, and probed for selected proteins. This analysis was performed on the very same lysate that were used for MS analysis (n = 2). The following antibodies were used: goat anti-AMPK alpha 2 (Santacruz, Dallas, USA), rabbit anti-HK II (Cell Signaling, Beverly, USA), rabbit anti-GLUT4 (Thermo scientific, Naerum, Denmark), and rabbit anti-GAPDH (Cell signaling, Beverly, USA). The anti-AMPK-a1 antibody (raised in sheep) was kindly provided by Prof. D. G. Hardie (University of Dundee, UK). In previous attempts at very deep proteome coverage of cell lines, we have employed protein level fractionation as well as several proteolytic enzymes (15Nagaraj N. Wisniewski J.R. Geiger T. Cox J. Kircher M. Kelso J. Paabo S. Mann M. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 548Crossref PubMed Scopus (750) Google Scholar). However, recent experience in our laboratory suggested that single enzyme digestion and fractionation only at the peptide level, when coupled to advanced MS instrumentation, would be sufficient to achieve great depth of protein identification (31Geiger T. Wehner A. Schaab C. Cox J. Mann M. Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins.Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11 (M111 014050)Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (577) Google Scholar). We therefore developed a streamlined workflow, consisting of cell line or tissue homogenization, filter-aided sample preparation (FASP) (23Wisniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 359-362Crossref PubMed Scopus (5042) Google Scholar), followed by peptide separation into twelve fractions according to their isoelectric point as described (24Hubner N.C. Ren S. Mann M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.Proteomics. 2008; 8: 4862-4872Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Peptides were measured by a linear quadrupole-Orbitrap mass analyzer, which achieves sub or low parts per million mass accuracy for peptide ions and their fragments (25Michalski A. Damoc E. Hauschild J.P. Lange O. Wieghaus A. Makarov A. Nagaraj N. Cox J. Mann M. Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M111 011015)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar). This streamlined method required only 1 day of measurement time for a single analysis each of the proteomes and computational analysis followed by automated computational analysis in the MaxQuant environment (26Cox J. Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p. p. b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1367-1372Crossref PubMed Scopus (9150) Google Scholar) (Fig. 1A–1C). We performed triplicate analyses of triceps muscles from C57BL/6J mice and of differentiated C2C12 cells and analyzed the results together in MaxQuant specifying a false discovery rate of 1% at the peptide and protein level. This identified a total of 10,218 proteins, a vastly larger number than reported in muscle proteome studies so far (Fig. 1D) (supplemental Table S1). A total of 8,309 proteins were identified in skeletal muscle, 9880 proteins in C2C12 myotubes, and 7,973 (78% of the total) proteins were identified in both systems. A mere 338 proteins were exclusively identified in the tissue. Interestingly, when skeletal muscle samples were analyzed separately, only 5,887 proteins were identified, whereas the corresponding number for myotubes was 9,624 (supplemental Table S2). This large difference is partially because of the complexity of the tissue and its large dynamic range, which makes MS analysis challenging. Peptides from a few highly abundant proteins of skeletal muscle interfere with the identification of lower abundant proteins, thereby reducing the overall number of identifications (Fig. 1B–1C). This is illustrated with a representative example from skeletal muscle: because of one high abundant peptide (originating from myosin), neighboring low abundant peptides are suppressed in comparison and may not be picked for fragmentation (Fig. 1B). This is not the case when analyzing C2C12 myotubes, where a larger number of peptides share approximately equal abundance and can all be fragmented and identified (Fig. 1C). Combined analysis of mouse skeletal muscle and C2C12 myotubes efficiently mitigated the challenge of dynamic range on protein identification in muscle tissue. MaxQuant aligned the retention times and–based on the accurately determined masses–efficiently transferred the peptide identification from C2C12 myotubes to more complex mouse skeletal muscle ("Match between runs" feature in MaxQuant). This identification, by matching is statistically controlled and high confidence of identification, is further indicated by the fact that 95% of the identified peptides were observed in a tight 0.4 min match time window (supplemental Fig. S1A). Altogether, this approach boosted protein identification by about 30%, which resulted in identification of 8,309 proteins in total in skeletal muscle (Fig. 1D–1E, supplemental Table S2). Most of proteins identified partially or exclusively by matching are of low abundance and include interesting regulatory classes such as skeletal muscle specific transcription factors (myod1, myog, mef2c), nuclear receptors (Smad1, Notch3), and circadian clock proteins (Bmal1, Cry1, Fbxl3) (supplemental Fig. S2A–S2B). Our experiment did not use isotope labeling but relied on label-free quantitation in the MaxQuant environment (28Cox J. Hein M.Y. Luber C.A. Paron I. Nagaraj N. Mann M. MaxLFQ allows accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13: 2513-2526Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2687) Google Scholar). We examined reproducibility of this procedure between biological triplicates and found very high correlations within the skeletal muscle and C2C12 groups (0.9–0.96, supplemental Fig. S1B). Using summed MS-signals ("abundances") of the peptides identifying each protein in the MS measurements, we estimated their contribution to the proteome. For protein isoforms, the shared peptides were counted as contributing to each of them. To obtain a global view of the dynamic range of the muscle proteome, the C2C12 myotube proteome and their differences, we plotted the cumulative contribution of each protein to total protein mass (Fig. 2A) as well as the individual, ranked abundance (Fig. 2A, 2B; supplemental Table S3). Combining the abundances of all identified heavy and light myosin isoforms results in 18% of total muscle mass, positioning myosin as the highest abundant protein in skeletal muscle. The giant protein titin (390 kDa) alone accounts for another 16% of total protein mass. The 10 most abundant proteins according to MS measurement were titin, myosin-4, nebulin, calcium ATPase 1, actin α, creatine kinase, α-actinine-3, glycogen phosphorylase, and myosin-1 and together they make up 50% of total protein mass in skeletal muscle. Actin and myosin are the key members of the contractile units (sarcomere) in muscle. The estimated ratio between actin/myosin abundances was ∼1:7. The summed abundance of proteins that are assigned to the contractile machinery by Gene Ontology Cellular Compartment (GOCC) annotation was 53.6% of total protein mass for skeletal muscle. The ranked distribution of all individual proteins revealed a much steeper decline of abundances for the tissue compared with the cell line (Fig. 2B). In skeletal muscle, the lower half of the proteome accounts for a negligible fraction of its total mass (<0.1%). Our data also allows us to determine the amino acid make up of mouse muscle proteome as the weighted contribution from all identified protein sequences. For instance, branched chain amino acids, which are important in protein synthesis, constitute 20.5% of all amino acids weighted by protein abundance, which is similar to values in other mouse tissues (supplemental Fig. S3). Although almost all proteins identified in muscle were also identified in C2C12 myotubes, these two model systems turned out to be quit

AMP-activated protein kinase (AMPK) is a sensor of cellular energy status that plays a central role in skeletal muscle metabolism. We used skeletal muscle-specific AMPKα1α2 double-knockout (mdKO) mice to provide direct genetic evidence of the physiological importance of AMPK in regulating muscle exercise capacity, mitochondrial function, and contraction-stimulated glucose uptake. Exercise performance was significantly reduced in the mdKO mice, with a reduction in maximal force production and fatigue resistance. An increase in the proportion of myofibers with centralized nuclei was noted, as well as an elevated expression of interleukin 6 (IL-6) mRNA, possibly consistent with mild skeletal muscle injury. Notably, we found that AMPKα1 and AMPKα2 isoforms are dispensable for contraction-induced skeletal muscle glucose transport, except for male soleus muscle. However, the lack of skeletal muscle AMPK diminished maximal ADP-stimulated mitochondrial respiration, showing an impairment at complex I. This effect was not accompanied by changes in mitochondrial number, indicating that AMPK regulates muscle metabolic adaptation through the regulation of muscle mitochondrial oxidative capacity and mitochondrial substrate utilization but not baseline mitochondrial muscle content. Together, these results demonstrate that skeletal muscle AMPK has an unexpected role in the regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation that contributes to the energy demands of the exercising muscle.—Lantier, L., Fentz, J., Mounier, R., Leclerc, J., Treebak, J. T., Pehmøller, C., Sanz, N., Sakakibara, I., Saint-Amand, E., Rimbaud, S., Maire, P., Marette, A., Ventura-Clapier, R., Ferry, A., Wojtaszewski, J. F. P., Foretz, M., Viollet, B. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB J. 28, 3211–3224 (2014). www.fasebj.org

Summary Circadian rhythms are generated by an auto-regulatory feedback loop composed of transcriptional activators and repressors. Disruption of circadian rhythms contributes to Type 2 diabetes (T2D) pathogenesis. We elucidated whether altered circadian rhythmicity of clock genes is associated with metabolic dysfunction in T2D. Transcriptional cycling of core clock genes ARNTL, CLOCK , CRY1 and NR1D1 was altered in skeletal muscle from individuals with T2D and this was coupled with reduced number and amplitude of cycling genes and disturbed circadian oxygen consumption. Mitochondrial associated genes were enriched for differential circadian amplitudes in T2D, and positively correlated with insulin sensitivity. ChIP- sequencing identified CLOCK and BMAL1 binding to circadian mitochondrial genes associated with insulin sensitivity, implicating regulation by the core clock. Mitochondria disruption altered core-clock gene expression and free-radical production, phenomena that were restored by resveratrol treatment. We identify bi-directional communication between mitochondrial function and rhythmic gene expression, processes which are disturbed in diabetes.

Abstract Skeletal muscle regulates glucose uptake in response to insulin and exercise which is critical for maintaining metabolic health. We conducted a comprehensive phosphoproteomic analysis of skeletal muscle from healthy people in response to an acute bout of exercise or insulin stimulation by a hyperinsulinemic euglycemic clamp. Our analysis revealed 233 phosphosites regulated by both exercise and insulin of which most phosphosites were regulated in opposite directions. However, 71 phosphosites on 55 proteins displayed regulation in the same direction, indicating a potential convergence of signaling pathways. We identified the vesicle-associated protein, REPS1, to be phosphorylated at Ser709 in response to both insulin and exercise. REPS1 protein level and Ser709 phosphorylation were closely related to insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle and required for maximal insulin-stimulated glucose uptake. Furthermore, we observed that insulin triggered phosphorylation of REPS1 Ser709 via P90S6 kinase (RSK) and is impaired in mice and humans with insulin resistance. Collectively, REPS1 is a convergence point for insulin and exercise signaling and a promising therapeutic target in insulin resistance.

ABSTRACT Objective: The metabolic master-switch AMP-activated protein kinase (AMPK) mediates insulin-independent glucose uptake in muscle and regulates the metabolic activity of brown and beige adipose tissue (BAT). The regulatory AMPKγ3 isoform is uniquely expressed in skeletal muscle and also potentially in BAT. Here, we investigated the role that AMPKγ3 plays in mediating skeletal muscle glucose uptake and whole-body glucose clearance in response to small-molecule activators that act on AMPK via distinct mechanisms. We also assessed if γ3 plays a role in adipose thermogenesis and browning. Methods: Global AMPKγ3 knockout (KO) mice were generated. A systematic whole-body, tissue and molecular phenotyping linked to glucose homeostasis was performed in γ3 KO and wild type (WT) mice. Glucose uptake in glycolytic and oxidative skeletal muscle ex vivo, as well as blood glucose clearance in response to small molecule AMPK activators that target nucleotide-binding domain of γ subunit (AICAR) and allosteric drug and metabolite (ADaM) site located at the interface of the α and β subunit (991, MK-8722) were assessed. Oxygen consumption, thermography, and molecular phenotyping with a β3-adrenergic receptor agonist (CL-316,243) treatment were performed to assess BAT thermogenesis, characteristics and function. Results: Genetic ablation of γ3 did not affect body weight, body composition, physical activity, and parameters associated with glucose homeostasis under chow or high fat diet. γ3 deficiency had no effect on fiber-type composition, mitochondrial content and components, or insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle. Glycolytic muscles in γ3 KO mice showed a partial loss of AMPKα2 activity, which was associated with reduced levels of AMPKα2 and β2 subunit isoforms. Notably, γ3 deficiency resulted in a selective loss of AICAR-, but not MK-8722-induced blood glucose-lowering in vivo and glucose uptake specifically in glycolytic muscle ex vivo . We detected γ3 in BAT and found that it preferentially interacts with α2 and β2. We observed no differences in oxygen consumption, thermogenesis, morphology of BAT and inguinal white adipose tissue (iWAT), or markers of BAT activity between WT and γ3 KO mice. Conclusions: These results demonstrate that γ3 plays a key role in mediating AICAR- but not ADaM site binding drug-stimulated blood glucose clearance and glucose uptake specifically in glycolytic skeletal muscle. We also showed that γ3 is dispensable for thermogenesis and browning of iWAT.

Reactive oxygen species (ROS) act as intracellular compartmentalized second messengers mediating metabolic stress-adaptation. In skeletal muscle fibers, ROS have been suggested to stimulate glucose transporter 4 (GLUT4)-dependent glucose transport during artificially evoked contraction ex vivo but whether myocellular ROS production is stimulated by in vivo exercise to control metabolism is unclear. Here, we combined exercise in humans and mice with fluorescent dyes, genetically-encoded biosensors, and NADPH oxidase 2 (NOX2) loss-of-function models to demonstrate that NOX2 is the main source of cytosolic ROS during moderate-intensity exercise in skeletal muscle. Furthermore, two NOX2 loss-of-function mouse models lacking either p47phox or Rac1 presented striking phenotypic similarities, including greatly reduced exercise-stimulated glucose uptake and GLUT4 translocation. These findings indicate that NOX2 is a major myocellular ROS source regulating glucose transport capacity during moderate-intensity exercise.