Abstract Repeat-associated non-AUG (RAN) translation allows for unconventional initiation at disease-causing repeat expansions. As RAN translation contributes to pathogenesis in multiple neurodegenerative disorders, determining its mechanistic underpinnings may inform therapeutic development. Here we analyze RAN translation at G 4 C 2 repeat expansions that cause C9orf72 -associated amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia (C9RAN) and at CGG repeats that cause fragile X-associated tremor/ataxia syndrome. We find that C9RAN translation initiates through a cap- and eIF4A-dependent mechanism that utilizes a CUG start codon. C9RAN and CGG RAN are both selectively enhanced by integrated stress response (ISR) activation. ISR-enhanced RAN translation requires an eIF2α phosphorylation-dependent alteration in start codon fidelity. In parallel, both CGG and G 4 C 2 repeats trigger phosphorylated-eIF2α-dependent stress granule formation and global translational suppression. These findings support a model whereby repeat expansions elicit cellular stress conditions that favor RAN translation of toxic proteins, creating a potential feed-forward loop that contributes to neurodegeneration.

Abstract Repeat associated non-AUG (RAN) translation of FMR1 5’ UTR CGG repeats produces toxic homo-polymeric proteins that accumulate within ubiquitinated inclusions in Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) patient brains and model systems. The most abundant RAN product, FMRpolyG, initiates predominantly at an ACG codon located just 5’ to the repeat. Methods to accurately measure FMRpolyG in FXTAS patients are lacking. Here we used data dependent acquisition (DDA) and parallel reaction monitoring (PRM) mass spectrometry coupled with stable isotope labeled standard peptides (SIS) to identify potential signature FMRpolyG fragments in patient cells and tissues. Following immunoprecipitation (IP) enrichment, we detected FMRpolyG signature peptides by PRM in transfected cells, FXTAS human samples and patient derived stem cells, but not in controls. Surprisingly, we identified two amino-terminal peptides: one beginning with methionine (Ac-MEAPLPGGVR) initiating at an ACG, and a second beginning with threonine (Ac-TEAPLPGGVR), initiating at a GUG. Abundance of the threonine peptide was enhanced relative to the methionine peptide upon activation of the integrated stress response. In addition, loss of the eIF2 alternative factor, eIF2A, or enhanced expression of initiation factor eIF1, preferentially suppressed GUG initiated FMRpolyG synthesis. These data demonstrate that FMRpolyG is quantifiable in human samples and that RAN translation on FMR1 initiates at specific near cognate codons dependent on available initiation factors and cellular environment.

Abstract Cellular stress pathways that inhibit translation initiation lead to transient formation of cytoplasmic RNA/protein complexes known as stress granules. Many of the proteins found within stress granules and the dynamics of stress granule formation and dissolution are implicated in neurodegenerative disease. Whether stress granule formation is protective or harmful in neurodegenerative conditions is not known. To address this, we took advantage of the alphavirus protein nsP3, which selectively binds dimers of the central stress granule nucleator protein G3BP and markedly reduces stress granule formation without directly impacting the protein translational inhibitory pathways that trigger stress granule formation. In Drosophila and rodent neurons, reducing stress granule formation with nsP3 had modest impacts on lifespan even in the setting of serial stress pathway induction. In contrast, reducing stress granule formation in models of ataxia, amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia largely exacerbated disease phenotypes. These data support a model whereby stress granules mitigate, rather than promote, neurodegenerative cascades.

ABSTRACT RNAs derived from expanded nucleotide repeats form detectable foci in patient cells and these foci are thought to contribute to disease pathogenesis. The most widely used method for detecting RNA foci is fluorescence in situ hybridization (FISH). However, FISH is prone to low sensitivity and photo-bleaching that can complicate data interpretation. Here we applied hybridization chain reaction (HCR) as an alternative approach to repeat RNA foci detection of GC-rich repeats in two neurodegenerative disorders: GGGGCC (G 4 C 2 ) hexanucleotide repeat expansions in C9orf72 that cause amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia (C9 ALS/FTD) and CGG repeat expansions in FMR1 that cause Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome. We found that HCR of both G 4 C 2 and CGG repeats has comparable specificity to traditional FISH, but is >40x more sensitive and shows repeat-length dependence in its intensity. HCR is better than FISH at detecting both nuclear and cytoplasmic foci in human C9 ALS/FTD fibroblasts, patient iPSC derived neurons, and patient brain samples. We used HCR to determine the impact of integrated stress response (ISR) activation on RNA foci number and distribution. G 4 C 2 repeat RNA did not readily co-localize with the stress granule marker G3BP1, but ISR induction increased both the number of detectible nuclear RNA foci and the nuclear/cytoplasmic foci ratio in patient fibroblasts and patient derived neurons. Taken together, these data suggest that HCR can be a useful tool for detecting repeat expansion mRNA in C9 ALS/FTD and other repeat expansion disorders.

Cellular stress pathways that inhibit translation initiation lead to transient formation of cytoplasmic RNA/protein complexes known as stress granules. Many of the proteins found within stress granules and the dynamics of stress granule formation and dissolution are implicated in neurodegenerative disease. Whether stress granule formation is protective or harmful in neurodegenerative conditions is not known. To address this, we took advantage of the alphavirus protein nsP3, which selectively binds dimers of the central stress granule nucleator protein G3BP (rin in Drosophila) and markedly reduces stress granule formation without directly impacting the protein translational inhibitory pathways that trigger stress granule formation. In Drosophila and rodent neurons, reducing stress granule formation with nsP3 had modest impacts on lifespan even in the setting of serial stress pathway induction. In contrast, reducing stress granule formation in models of ataxia, amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia largely exacerbated disease phenotypes. These data support a model whereby stress granules mitigate, rather than promote, neurodegenerative cascades.

Abstract The nuclear RNA-binding protein TDP43 is integrally involved in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal lobar degeneration (FTLD). Previous studies uncovered N-terminal TDP43 isoforms that are predominantly cytosolic in localization, highly prone to aggregation, and enriched in susceptible spinal motor neurons. In healthy cells, however, these shortened (s)TDP43 isoforms are difficult to detect in comparison to full-length (fl)TDP43, raising questions regarding their origin and selective regulation. Here, we show that sTDP43 is created as a byproduct of TDP43 autoregulation and cleared by nonsense mediated RNA decay (NMD). The sTDP43-encoding transcripts that escape NMD can lead to toxicity but are rapidly degraded post-translationally. Circumventing these regulatory mechanisms by overexpressing sTDP43 results in neurodegeneration in vitro and in vivo via N-terminal oligomerization and impairment of flTDP43 splicing activity, in addition to RNA binding-dependent gain-of-function toxicity. Collectively, these studies highlight endogenous mechanisms that tightly regulate sTDP43 expression and provide insight into the consequences of aberrant sTDP43 accumulation in disease.

Highlights•Short (s)TDP43 isoforms are created as a by-product of TDP43 autoregulation•sTDP43 is strictly regulated by NMD, the proteasome, and autophagy•sTDP43 is a potent inhibitor of TDP43 splicing activitySummaryThe nuclear RNA-binding protein TDP43 is integrally involved in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal lobar degeneration (FTLD). Previous studies uncovered N-terminal TDP43 isoforms that are predominantly cytosolic in localization, prone to aggregation, and enriched in susceptible spinal motor neurons. In healthy cells, however, these shortened (s)TDP43 isoforms are difficult to detect in comparison to full-length (fl)TDP43, raising questions regarding their origin and selective regulation. Here, we show that sTDP43 is created as a by-product of TDP43 autoregulation and cleared by nonsense-mediated RNA decay (NMD). sTDP43-encoding transcripts that escape NMD are rapidly degraded post-translationally via the proteasome and macroautophagy. Circumventing these regulatory mechanisms by overexpressing sTDP43 results in neurodegeneration via N-terminal oligomerization and impairment of flTDP43 splicing activity, in addition to RNA-binding-dependent gain-of-function toxicity. Collectively, these studies highlight endogenous mechanisms that tightly regulate sTDP43 expression and underscore the consequences of aberrant sTDP43 accumulation in disease.Graphical abstract