Stem cell differentiation involves a global increase in protein synthesis to meet the demands of specialized cell types. However, the molecular mechanisms underlying this translational burst and the involvement of initiation factors remains largely unknown. Here, we investigate the roles of eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) in early differentiation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neural progenitor cells (NPCs). Using Quick-irCLIP and alternative polyadenylation (APA) Seq, we show eIF3 crosslinks to many neurologically relevant mRNAs in NPCs. Our data reveal eIF3 predominantly interacts with 3′ untranslated region (3′- UTR) termini of multiple mRNA isoforms, adjacent to the poly(A) tail. High eIF3 crosslinking at 3′-UTR termini of mRNAs correlates with high translational activity, as determined by ribosome profiling. We identify the transcriptional regulator inhibitor of DNA binding 2 (ID2) mRNA as a case in which active translation levels and eIF3 crosslinking are dramatically increased upon early NPC differentiation. Furthermore, we find that eIF3 engagement at 3′-UTR ends is dependent on polyadenylation. The results presented here show that eIF3 engages with 3′-UTR termini of highly translated mRNAs, supporting a role of mRNA circularization in the mechanisms governing mRNA translation in NPCs.

Substantial similarities and profound differences mark ribosomes across phylogeny. The ribosomal core is universal, yet mammalian ribosomes are nearly twice as large as those of prokaryotes. This difference in size is predominantly due to the extension of specific rRNA regions called expansion segments. Here, we characterize expansion segment 7 of the 28S rRNA from Homo sapiens by computation, circular dichroism, gel mobility, fluorescent probes, nuclease accessibility, electrophoretic mobility shifts and blotting. Our results indicate that, in a cell-free environment, G-quadruplexes form in human ES7, or 28S rRNA, and in 80S ribosomes or polysomes purified from human cell lines. rRNA G-quadruplex regions are preferentially located on the most surface-exposed regions of the ribosome, near the termini of specific rRNA tentacles in ES7 and ES27. By multiple sequence alignments, we have inferred that G-quadruplex-forming sequences appear to be a general feature of the surfaces of ribosomes of the phylum Chordata. In this study, we also identify the proteins that bind selectively to the rRNA G-quadruplexes, which include several RNA helicases and other RNA remodeling proteins. It is known that G-quadruplexes are contained in telomeres, promoters, and untranslated regions of mRNA but, to our knowledge, they have not been reported to form in ribosomes.

Abstract Heme b (iron protoporphyrin IX) plays important roles in biology as a metallocofactor and signaling molecule. However, the targets of heme signaling and the network of proteins that mediate the exchange of heme from sites of synthesis or uptake to heme dependent or regulated proteins are poorly understood. Herein, we describe a quantitative mass spectrometry-based chemoproteomics strategy to identify exchange labile hemoproteins in human embryonic kidney HEK293 cells that may be relevant to heme signaling and trafficking. The strategy involves depleting endogenous heme with the heme biosynthetic inhibitor succinylacetone (SA), leaving putative heme binding proteins in their apo- state, followed by the capture of those proteins using hemin-agarose resin and finally elution and identification by mass spectrometry. By identifying only those proteins that interact with high specificity to hemin-agarose relative to control beaded agarose in a SA-dependent manner, we have expanded the number of proteins and ontologies that may be involved in binding and buffering labile heme or are targets of heme signaling. Notably, these include proteins involved in chromatin remodeling, DNA damage response, RNA splicing, cytoskeletal organization and vesicular trafficking, many of which have been associated with heme through complimentary studies published recently. Taken together, these results provide support for the emerging role for heme in an expanded set of cellular processes from genome integrity to protein trafficking and beyond.

The in vitro formation of stable G-quadruplexes (G4s) in human ribosomal RNA (rRNA) was recently reported. However, their formation in cells and their cellular roles have not been resolved. Here, by taking a chemical biology approach that integrates results from immunofluorescence, G4 ligands, heme affinity reagents, and a genetically encoded fluorescent heme sensor, we report that human ribosomes can form G4s in vivo that regulate heme bioavailability. Immunofluorescence experiments indicate that the vast majority of extra-nuclear G4s are associated with rRNA. Moreover, titrating human cells with a G4 ligand alters the ability of ribosomes to bind heme and disrupts cellular heme bioavailability as measured by a genetically encoded fluorescent heme sensor. Overall, these results suggest ribosomes are central hubs of heme metabolism.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.