Fungi of the recently defined order Sebacinales (Basidiomycota) are involved in a wide spectrum of mutualistic symbioses (including mycorrhizae) with various plants, thereby exhibiting a unique potential for biocontrol strategies. The axenically cultivable root endophyte Piriformospora indica is a model organism of this fungal order. It is able to increase biomass and grain yield of crop plants. In barley, the endophyte induces local and systemic resistance to fungal diseases and to abiotic stress. To elucidate the lifestyle of P. indica , we analyzed its symbiotic interaction and endophytic development in barley roots. We found that fungal colonization increases with root tissue maturation. The root tip meristem showed no colonization, and the elongation zone showed mainly intercellular colonization. In contrast, the differentiation zone was heavily infested by inter- and intracellular hyphae and intracellular chlamydospores. The majority of hyphae were present in dead rhizodermal and cortical cells that became completely filled with chlamydospores. In some cases, hyphae penetrated cells and built a meshwork around plasmolyzed protoplasts, suggesting that the fungus either actively kills cells or senses cells undergoing endogenous programmed cell death. Seven days after inoculation, expression of barley BAX inhibitor-1 ( HvBI-1 ), a gene capable of inhibiting plant cell death, was attenuated. Consistently, fungal proliferation was strongly inhibited in transgenic barley overexpressing GFP-tagged HvBI-1, which shows that P. indica requires host cell death for proliferation in differentiated barley roots. We suggest that the endophyte interferes with the host cell death program to form a mutualistic interaction with plants.

Significance We demonstrate that host-induced gene silencing (HIGS) targeting the fungal sterol 14α-demethylase ( CYP51 ) genes restricts Fusarium infection in plants. Fusarium diseases have a significant impact not only on global grain production, but also on food safety because of grain contamination with mycotoxins. We capitalized on the knowledge that demethylation inhibitor fungicides target cytochrome P450 lanosterol C-14α-demethylase. In Fusarium graminearum ( Fg ), this enzyme is encoded by three paralogous genes. Transgenic Arabidopsis and barley expressing a double-stranded RNA targeting all three CYP51 genes exhibited complete immunity to Fg . Our results provide proof-of-concept that HIGS of the CYP51 genes is an effective strategy for controlling Fusarium , demonstrating that HIGS is a powerful tool, which could revolutionize crop plant protection.

Abstract Macrophage migration inhibitory factors (MIF) are multifunctional proteins regulating major processes in mammals, including activation of innate immune responses. In invertebrates, MIF proteins participate in the modulation of host immune responses when secreted by parasitic organisms, such as aphids. In this study, we assessed the possibility to use MIF genes as targets for RNA interference (RNAi)-based control of the grain aphid Sitobion avenae ( Sa ) on barley ( Hordeum vulgare ). When nymphs were fed on artificial diet containing double-stranded (ds)RNAs ( SaMIF -dsRNAs) that target sequences of the three MIF genes SaMIF1, SaMIF2 and SaMIF3 , they showed higher mortality rates and these rates correlated with reduced MIF transcript levels as compared to the aphids feeding on artificial diet containing a control dsRNA ( GFP -dsRNA). Comparison of different feeding strategies showed that nymphs’ survival was not altered when they fed from barley seedlings sprayed with SaMIF -dsRNAs, suggesting they did not effectively take up dsRNA from the sieve tubes of these plants. Furthermore, aphids’ survival was also not affected when the nymphs fed on leaves supplied with dsRNA via basal cut ends of barley leaves. Consistent with this finding, the use of sieve-tube-specific YFP-labeled Arabidopsis reporter lines confirmed that fluorescent 21 nt dsRNA Cy3 supplied via petioles co-localized with xylem structures, but not with phloem tissue. Our results suggest that MIF genes are a potential target for insect control and also imply that application of naked dsRNA to plants for aphid control is inefficient. More efforts should be put into the development of effective dsRNA formulations.

Abstract Circular RNAs (circRNAs) are single-stranded molecules that have attracted increasing attention in recent years due to their covalently closed structure and their diverse functional roles in mammalian cells, where they are involved in the regulation of gene expression and protein function. Increasing evidence suggests that circRNAs have similar functions in plants, where they play a role in plant development, resistance to biotic stress, and abiotic stress tolerance. Here, we investigated the agronomically relevant question of whether synthetic designer circRNAs can be used to modulate in a sequence-specific manner gene expression in plants. We show that treatment of GFP -expressing Arabidopsis protoplasts with designer 50 nt GFP antisense circRNA (circRNA GFP ) reduces the cellular accumulation of the reporter protein in a sequence-specific and dose-dependent manner. This inhibitory activity of circRNA GFP was not abolished in various Arabidopsis ago and dcl mutants with defective RNAi pathways. Moreover, and in contrast to other types of RNA such as double-stranded (ds)RNA, circRNAs did not induce a PTI response in plant leaves. We discuss the possibility that circRNA may be applied to regulate endogenous plant genes and thus may have future potential as a novel bioherbicide.

Abstract Grasses exhibit a large variety of diverse inflorescence architectures, from complex branched inflorescences in Oryzeae (rice) to simple spike-type inflorescences in Triticeae (e.g. barley, wheat). Inflorescence architecture depends on shape, longevity and determinacy of meristems that direct growth of the main rachis and lateral branches, but how individual meristem activities are determined and integrated within complex inflorescences is not yet understood. We found that activity of distinct meristems in the barley inflorescence is coordinated by a signalling pathway comprising the receptor like kinase Hordeum vulgare CLAVATA1 (HvCLV1) and the secreted CLAVATA3/ENDOSPERM SURROUNDING REGION (CLE)-family peptide FON2- LIKE CLE PROTEIN1 (HvFCP1). HvFCP1 interacts with HvCLV1 to promote spikelet formation but restricts inflorescence meristem and rachilla meristem proliferation. Hvfcp1 or Hvclv1 mutants generate branched inflorescences with additional rows of spikelets and supernumerary florets. Transcriptome analysis reveals that HvFCP1/HvCLV1 signalling controls inflorescence branching through the regulation of trehalose-6-phosphate synthesis and sugar transport. Our discoveries reveal the potential to engineer barley inflorescence architecture by manipulating regulation of distinct meristem activities.

The phytohormones auxin and cytokinin influence the development and maintenance of plant stem cell niches. Although barley (Hordeum vulgare) is the fourth most abundant cereal crop plant, the knowledge about these important phytohormones in regard to the root and shoot stem cell niche in barley is still negligible. In this study, we analyse the influence of auxin and cytokinin on the barley root meristem and present reporter lines to describe the auxin and cytokinin signalling output. Application of high concentrations of auxin and cytokinin to barley seedlings had a negative influence on barley root and meristem growth. The expression of the cytokinin reporter TCSn revealed that cytokinin signalling mostly takes place in the stele cells proximal to the QC and in the differentiated root cap cells, but can additionally be activated in the root stem cell niche by cytokinin application. Analysing signalling targets of auxin showed that a homologue of AtPLT1, HvPLT1, is expressed in a similar way as AtPLT1 in Arabidopsis, in particular in the QC and the surrounding cells. Furthermore, a homologue of the auxin PIN transporters PIN1, HvPIN1, was expressed in the root and the shoot meristem and polarly localizes to the plasma membrane. Its expression is regulated by cytokinin and the intracellular localisation is affected by BFA. With this study, we provide a valuable tool set of fluorescent barley reporter lines for auxin and cytokinin.

Summary MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR (MIF) is a pleiotropic protein with chemotactic, pro-inflammatory, and growth-promoting activities first discovered in mammals. In parasites, MIF homologs are involved in immune evasion and pathogenesis. Here, we present the first comprehensive analysis of a MIF protein from the devastating plant pathogen Magnaporthe oryzae ( Mo ). The fungal genome encodes a single MIF protein ( Mo MIF1) that, unlike the human homolog, harbors multiple low-complexity regions (LCRs) and is unique to Ascomycota. Following infection, MoMIF1 is expressed in the biotrophic phase of the fungus, and is strongly down-regulated during subsequent necrotrophic growth in leaves and roots. We show that Mo MIF1 is secreted during plant infection, affects the production of the mycotoxin tenuazonic acid and inhibits plant cell death. Our results show that Mo MIF1 is a novel key regulator of fungal virulence that maintains the balance between biotrophy and necrotrophy during the different phases of fungal infection.

The root growth angle defines how roots grow towards the gravity vector and is among the most important determinants of root system architecture. It controls water uptake capacity, nutrient use efficiency, stress resilience and as a consequence yield of crop plants. We demonstrated that the ( ) mutant of barley exhibits steeper root growth of seminal and lateral roots and an auxin independent higher responsiveness to gravity compared to wild type plants. We cloned the gene by a combination of bulked segregant analysis and whole genome sequencing. Subsequent validation experiments by an independent CRISPR/Cas9 mutant allele demonstrated that encodes a STERILE ALPHA MOTIF domain containing protein. hybridization experiments illustrated that is expressed from the root cap to the elongation zone. Subcellular localization experiments revealed that localizes to the nucleus and cytoplasm. We demonstrated the evolutionary conserved role of in root growth angle control between barley and wheat by knocking out the orthologs in the A and B genomes of tetraploid durum wheat. By combining laser capture microdissection with RNA-seq, we observed that seven expansin genes were transcriptionally downregulated in the elongation zone. This is consistent with a role of in this region of the root where the effect of gravity sensing is executed by differential cell elongation. Our findings suggest that is an evolutionary conserved regulator of root growth angle in barley and wheat that could be a valuable target for root-based crop improvement strategies in cereals.

Gene silencing through RNA interference (RNAi) shapes many biological processes in filamentous fungi, including pathogenicity. In this study we explored the requirement of key components of fungal RNAi machinery, including DICER-like 1 and 2 ( Fg DCL1, Fg DCL2), ARGONAUTE 1 and 2 ( Fg AGO1, Fg AGO2), AGO-interacting protein Fg QIP (QDE2-interacting protein), RecQ helicase ( Fg QDE3), and four RNA-dependent RNA polymerases ( Fg RdRP1, Fg RdRP2, Fg RdRP3, Fg RdRP4), in the ascomycete mycotoxin-producing fungal pathogen Fusarium graminearum ( Fg ) for sexual and asexual multiplication, pathogenicity, and its sensitivity to double-stranded (ds)RNA. We corroborate and extend earlier findings that conidiation, ascosporogenesis and Fusarium Head Blight (FHB) symptom development require an operable RNAi machinery. The involvement of RNAi in conidiation is dependent on environmental conditions as it is detectable only under low light (< 2 µmol m−2s−1). Although both DCLs and AGOs partially share their functions, the sexual ascosporogenesis is mediated primarily by Fg DCL1 and Fg AGO2, while Fg DCL2 and Fg AGO1 contribute to asexual conidia formation and germination. Fg DCL1 and Fg AGO2 also account for pathogenesis as their knock-out (KO) results in reduced FHB development. Apart from KO mutants Δdcl2 and Δago1 , mutants Δrdrp2, Δrdrp3, Δrdrp4, Δqde3 and Δqip are strongly compromised for conidiation, while KO mutations in all RdPRs, QDE3 and QIP strongly affect ascosporogenesis. Analysis of trichothecenes mycotoxins in wheat kernels showed that the relative amount of deoxynivalenol (DON), calculated as [DON] per amount of fungal genomic DNA, was reduced in all spikes infected with RNAi mutants, suggesting the possibility that the fungal RNAi pathways affect Fg ’s DON production in wheat spikes. Moreover, gene silencing by exogenous target gene specific dsRNA (spray-induced gene silencing, SIGS) is dependent on fungal DCLs, AGOs, and QIP, but not on QDE3. Together these data show that in F. graminearum different key components of the RNAi machinery are crucial in different steps of fungal development and pathogenicity.* AGO : ARGONAUTE CYP51 : Cytochrome P450 lanosterol C-14α-demethylase DCL : DICER-like DON : deoxynivalenol Fg : Fusarium graminearum FHB : Fusarium head blight HIGS : host-induced gene silencing hpRNA : hairpin RNA MSUD : meiotic silencing by unpaired DNA NIV : nivalenol PEG : potato extract glucose QDE 2,3 : Quelling defective 2,3 QIP : QDE-interacting protein RdRp : RNA-dependent RNA polymerase RISC : RNA-dependent silencing complex RNAi : RNA interference RPA : subunit of replication protein A siRNA : small interfering RNA SN : synthetic nutrient agar ssDNA : single-stranded TGW : thousand grain weight

Abstract Leaf or brown rust caused by Puccinia triticina Eriks. ( Pt ) is a major biotic constraint threatening bread wheat production worldwide. The continued evolution of new races of Pt necessitates a constant search for the identification of new resistance genes, or QTLs, to enhance the resistance durability of bread varieties. On a panel of 320 bread wheat accessions, we used a genome-wide association study (GWAS) technique to map loci associated with Pt resistance using single-nucleotide polymorphism markers (SNPs) generated by genotyping-by-sequencing (GBS). The panel was tested with five Pt races gathered from different regions of IRAN to identify loci associated with seedling resistance. After estimating genetic relatedness and population structure among accessions, GWAS discovered a total of 19 SNPs on chromosomes 1B, 2B, 3A, 3B, 4A, 5B, 5D, 6A, 6B, 6D, 7B, and 7D that were significantly associated with seedling stage resistance. The three SNP markers rs12954, rs34220, and rs42447 on chromosomes 5D, 6A, and 7D, respectively, associated with resistance to Pt race PKTTS expressing potential new loci for leaf rust resistance. Overall, this research gives an integrated perspective of leaf rust resistance resources in Iranian bread wheat and recognizes new resistance loci that will be valuable to expand the set of resistance genes available to control this serious disease.