ABSTRACT Single-cell RNAseq has allowed unprecedented insight into gene expression across different cell populations in normal tissue and disease states. However, almost all studies rely on annotated gene sets to capture gene expression levels and sequencing reads that do not align to known genes are discarded. Here, we discover thousands of long noncoding RNAs (lncRNAs) expressed in human mammary epithelial cells and analyze their expression in individual cells of the normal breast. We show that lncRNA expression alone can discriminate between luminal and basal cell types and define subpopulations of both compartments. Clustering cells based on lncRNA expression identified additional basal subpopulations, compared to clustering based on annotated gene expression, suggesting that lncRNAs can provide an additional layer of information to better distinguish breast cell subpopulations. In contrast, these breast-specific lncRNAs poorly distinguish brain cell populations, highlighting the need to annotate tissue-specific lncRNAs prior to expression analyses. We also identified a panel of 100 breast lncRNAs that could discern breast cancer subtypes better than protein-coding markers. Overall, our results suggest that lncRNAs are an unexplored resource for new biomarker and therapeutic target discovery in the normal breast and breast cancer subtypes.

ABSTRACT Background: Short-read RNA sequencing (RNAseq) has widely been used to sequence RNA from a wide range of different tissues, developmental stages and species. However, the technology is limited by inherent biases and its inability to capture full-length transcripts. Long-read RNAseq overcomes these issues by providing reads that can span multiple exons, resolve complex repetitive regions and the capability to cover entire transcripts. Unfortunately, this technology is still prone to higher error rates. Noncoding RNA transcripts are highly specific to different cell types and tissues and remain underrepresented in current reference annotations. This problem is exacerbated by the dismissal of sequenced reads that align to genomic regions that do not contain annotated transcripts, resulting in approximately half of the expressed transcripts being overlooked in transcriptional studies. Results: We have developed a pipeline, named HyDRA (Hybrid de novo RNA assembly), which combines the precision of short reads with the structural resolution of long reads, enhancing the accuracy and reliability of custom transcriptome assemblies. Deep, short- and long-read RNAseq data derived from ovarian and fallopian tube samples were used to develop, validate and assess the efficacy of HyDRA. We identified more than 50,000 high-confidence long noncoding RNAs, most of which have not been previously detected using traditional methods. Conclusions: HyDRA's assembly performed more than 40% better than a similar assembly obtained with the top-ranked stand-alone de novo transcriptome short-read-only assembly tool and over 30% better than one obtained with the best-in-class multistep short-read-only approach. Although long-read sequencing is rapidly advancing, the vast availability of short-read RNAseq data will ensure that hybrid approaches like the one implemented in HyDRA continue to be relevant, allowing the discovery of high-confidence transcripts within specific cell types and tissues. As the practice of performing hybrid de novo transcriptome assemblies becomes commonplace, HyDRA will advance the annotation of coding and noncoding transcripts and expand our knowledge of the noncoding genome.

Abstract An early symptom of Alzheimer’s disease (AD) is an impaired sense of smell, for which the molecular basis remains elusive. Here, we generated human olfactory neurosphere-derived (ONS) cells from people with AD and mild cognitive impairment (MCI), and performed global RNA sequencing to determine gene expression changes. ONS cells expressed markers of neuroglial differentiation, providing a unique cellular model to explore early AD-associated disease pathways. Our transcriptomics data from ONS cells revealed differentially expressed genes (DEGs) associated with cognitive processes in AD cells compared to MCI, or matched healthy controls (HC). A-Kinase Anchoring Protein 6 ( AKAP6) was the most significantly altered gene in AD compared to both MCI and HC, and has been linked to cognitive function. The greatest change in gene expression of all DEGs occurred between AD and MCI. Gene pathway analysis revealed defects in multiple cellular processes with aging, intellectual deficiency and alternative splicing being the most significantly dysregulated in AD ONS cells. Our results demonstrate that ONS cells can provide a cellular model for AD that recapitulates disease-associated differences. We have revealed potential novel genes, including AKAP6 that may have a role in AD, particularly MCI to AD transition, and should be further examined.

Long noncoding RNAs (lncRNAs) have surpassed the number of protein-coding genes, yet the majority have no known function. We previously discovered >800 lncRNAs at regions identified by breast cancer genome-wide association studies (GWAS). Here, we performed a pooled CRISPR-Cas13d RNA knockdown screen to identify which of these lncRNAs altered cell proliferation. We found that KILR, a lncRNA that functions as a tumor suppressor, safeguards breast cells against uncontrolled proliferation. The half-life of KILR is significantly reduced by the risk haplotype, revealing an alternative mechanism by which variants alter cancer risk. We showed that KILR sequesters RPA1, a subunit of the RPA complex, required for DNA replication and repair. Reduced KILR expression promotes cell proliferation by increasing the available pool of RPA1 and the speed of DNA replication. Our findings confirm lncRNAs as mediators of breast cancer risk, emphasize the need to annotate noncoding transcripts in relevant cell types when investigating GWAS variants and provide a scalable platform for mapping phenotypes associated with lncRNAs.