Abstract B cell activation leads to proliferation and Ab production that can protect from pathogens or promote autoimmunity. Regulation of cell metabolism is essential to support the demands of lymphocyte growth and effector function and may regulate tolerance. In this study, we tested the regulation and role of glucose uptake and metabolism in the proliferation and Ab production of control, anergic, and autoimmune-prone B cells. Control B cells had a balanced increase in lactate production and oxygen consumption following activation, with proportionally increased glucose transporter Glut1 expression and mitochondrial mass upon either LPS or BCR stimulation. This contrasted with metabolic reprogramming of T cells, which had lower glycolytic flux when resting but disproportionately increased this pathway upon activation. Importantly, tolerance greatly affected B cell metabolic reprogramming. Anergic B cells remained metabolically quiescent, with only a modest increase in glycolysis and oxygen consumption with LPS stimulation. B cells chronically stimulated with elevated BAFF, however, rapidly increased glycolysis and Ab production upon stimulation. Induction of glycolysis was critical for Ab production, as glycolytic inhibition with the pyruvate dehydrogenase kinase inhibitor dichloroacetate sharply suppressed B cell proliferation and Ab secretion in vitro and in vivo. Furthermore, B cell–specific deletion of Glut1 led to reduced B cell numbers and impaired Ab production in vivo. Together, these data show that activated B cells require Glut1-dependent metabolic reprogramming to support proliferation and Ab production that is distinct from T cells and that this glycolytic reprogramming is regulated in tolerance.

Germinal center (GC) B cells evolve toward increased affinity by a Darwinian process that has been studied primarily in genetically restricted, hapten-specific responses. We explored the population dynamics of genetically diverse GC responses to two complex antigens—Bacillus anthracis protective antigen and influenza hemagglutinin—in which B cells competed both intra- and interclonally for distinct epitopes. Preferred VH rearrangements among antigen-binding, naive B cells were similarly abundant in early GCs but, unlike responses to haptens, clonal diversity increased in GC B cells as early “winners” were replaced by rarer, high-affinity clones. Despite affinity maturation, inter- and intraclonal avidities varied greatly, and half of GC B cells did not bind the immunogen but nonetheless exhibited biased VH use, V(D)J mutation, and clonal expansion comparable to antigen-binding cells. GC reactions to complex antigens permit a range of specificities and affinities, with potential advantages for broad protection.

ABSTRACT Antibody immunodominance is the asymmetric elicitation of responses against protein antigens. For influenza hemagglutinin (HA), antibody responses often target variable regions on HA and do not provide lasting protection. Next-generation influenza vaccines should elicit antibodies targeting conserved regions such as the receptor binding site (RBS). Understanding how presenting an epitope on a rationally-designed immunogen influences immune responses could help achieve this goal. Here, we compared an engineered RBS-enriched immunogen and its non-enriched counterparts to characterize RBS-directed responses. We found that enriching the RBS-epitope on a single immunogen preferentially expands RBS-directed responses relative to a cocktail of the non-epitope-enriched immunogens. Single B cell analyses showed a genetically diverse RBS-directed population that structural characterization showed engagement of the RBS with canonical features shared with both its receptor and human broadly neutralizing antibodies. These data show how epitope-enriched immunogens can expand responses to a conserved viral site, while maintaining genetic and structural diversity.

Abstract The first encounter with influenza virus biases later immune responses. This “immune imprinting”, formerly from infection within a few years of birth, is in the U.S. now largely from immunization with a quadrivalent, split vaccine (IIV4). In a pilot study of IIV4 imprinting, we characterized, by single-B-cell cultures, NextGen sequencing, and plasma antibody proteomics, the primary antibody responses to influenza in two infants during their first two years of seasonal influenza vaccination. One infant, who received only a single vaccination in Year 1, contracted an influenza B (IBV) infection between the two years, allowing us to compare imprinting by infection and vaccination. That infant had a shift in hemagglutinin (HA)-reactive B-cell specificity from largely influenza A (IAV)-specific in Year 1 to IBV-specific in Year 2, both before and after vaccination. HA-reactive B cells from the other infant maintained a more evenly distributed specificity. In Year 2, class-switched HA-specific B cell IGHV somatic hypermutation (SHM) levels reached average levels seen in adults. The HA-reactive plasma antibody repertoires of both infants comprised a relatively small number of antibody clonotypes, with one or two very abundant clonotypes. Thus, after the Year 2 boost, both infants had overall B cell profiles that resembled those of adult controls. Importance Influenza virus is a moving target for the immune system. Variants emerge that escape protection from antibodies elicited by a previously circulating variant (“antigenic drift”). The immune system usually responds to a drifted influenza virus by mutating existing antibodies rather than by producting entirely new ones. Thus, immune memory of the earliest influenza exposure has a major influence on later responses to infection or vaccination (“immune imprinting”). In the many studies of influenza immunity in adult subjects, imprinting has been from an early infection, since only in the past two decades have infants received influenza immunizations. The work reported in this paper is a pilot study of imprinting in two infants by the flu vaccine, which they received before experiencing an influenza infection. The results suggest that a quadrivalent (four-subtype) vaccine may provide an immune imprint less dominated by one subtype than does a monovalent infection.

Influenza infection and vaccination impart strain-specific immunity that fails to protect against both seasonal antigenic variants and the next pandemic. However, antibodies directed to conserved sites can confer broad protection. We identify and characterize a class of human antibodies that engage a previously undescribed, conserved, epitope on the influenza hemagglutinin protein (HA). Prototype antibody S8V1-157 binds at the normally occluded interface between the HA head and stem. Antibodies to this HA head-stem interface epitope are non-neutralizing in vitro but protect against lethal infection in mice. Their breadth of binding extends across most influenza A serotypes and seasonal human variants. Antibodies to the head-stem interface epitope are present at low frequency in the memory B cell populations of multiple donors. The immunogenicity of the epitope warrants its consideration for inclusion in improved or universal influenza vaccines.

ABSTRACT Novel animal influenza viruses emerge, initiate pandemics and become endemic seasonal variants that have evolved to escape from prevalent herd immunity. These processes often outpace vaccine-elicited protection. Focusing immune responses on conserved epitopes may impart durable immunity. We describe a focused, protective antibody response, abundant in memory and serum repertoires, to a conserved region at the influenza hemagglutinin head interface. Structures of eleven examples, eight reported here, from seven human donors demonstrate the convergence of responses on a single epitope. The eleven are genetically diverse, with one class having a common, IGκV1-39, light chain. All of the antibodies bind HAs from multiple serotypes. The lack of apparent genetic restriction and potential for elicitation by more than one serotype may explain their abundance. We define the head interface as a major target of broadly protective antibodies with the potential to influence the outcomes of influenza infection.

Abstract Antibody titers that inhibit the influenza virus hemagglutinin (HA) from engaging its receptor are the accepted correlate of protection from infection. Many potent antibodies with broad, intra-subtype specificity bind HA at the receptor binding site (RBS). One barrier to broad H1-H3 cross-subtype neutralization is an insertion (133a) between positions 133 and 134 on the rim of the H1 HA RBS. We describe here a class of antibodies that overcome this barrier. These genetically unrestricted antibodies are abundant in the human B-cell memory compartment. Analysis of the affinities of selected members of this class for historical H1 and H3 isolates suggest that they were elicited by H3 exposure and broadened or diverted by later exposure(s) to H1 HA. RBS mutations in egg-adapted vaccine strains cause the new H1 specificity of these antibodies to depend on the egg adaptation. The results suggest that suitable immunogens might elicit 133a-independent, H1-H3 cross neutralization by RBS-directed antibodies.

Abstract Re-entry of memory B cells to recall germinal centers (GCs) is essential for updating their B-cell antigen receptors (BCRs). Using single B-cell culture and fate-mapping, we have characterized BCR repertoires in recall GCs following boost immunizations at sites local or distal to the priming. Local boosts with homologous antigen recruit to recall GCs progeny of primary GC B cells more efficiently than do distal boosts. Recall GCs following local boosts contain significantly more B cells with elevated levels of Ig mutations and higher avidity BCRs. This local preference is unaffected by blockade of CD40:CD154 interaction that terminate active, primary GC responses. Local boosts with heterologous antigens elicit secondary GCs with B-cell populations enriched for cross-reactivity to the priming and boosting antigens; in contrast, cross-reactive GC B cells are rare following distal boosts. Our findings indicate the importance of locality in humoral immunity and inform serial vaccination strategies for evolving viruses. One Sentence Summary The participation of memory B cells in recall germinal centers depends on whether the boost is local or distal to the priming site.

Antigenic variation and viral evolution have thwarted traditional influenza vaccination strategies. The broad protection afforded by a "universal" influenza vaccine will come from immunogens that elicit humoral immune responses targeting conserved epitopes on the viral hemagglutinin (HA), such as the receptor-binding site (RBS). Here, we engineered candidate immunogens that use non-circulating, avian influenza HAs as molecular scaffolds to present the broadly neutralizing RBS epitope from historical, circulating H1 influenzas. These "resurfaced" HAs (rsHAs) remove epitopes potentially targeted by strain-specific responses in immune-experienced individuals. Through structure-guided optimization we improved two antigenically different scaffolds to bind a diverse panel of pan-H1 and H1/H3 cross-reactive bnAbs with high affinity. Subsequent serological analyses from murine prime-boost immunizations show that the rsHAs are both immunogenic and can enrich for RBS-directed antibodies. Our structure-guided, RBS grafting approach provides candidate immunogens for selectively presenting a conserved viral epitope.

ABSTRACT Naegleria fowleri ( N. fowleri ) infection via the upper respiratory tract causes a fatal CNS disease known as primary amoebic meningoencephalitis (PAM). The robust in vivo immune response to N. fowleri infection underlies the immunopathology that characterizes the disease. However, little is known about why this pathogen evades immune control. Infections occur in seemingly healthy individuals and effective clinical options are lacking, thus a nearly 98% fatality rate. It is unclear how or if host factors may contribute to susceptibility or disease exacerbation, yet mechanistic studies of the in vivo immune response and disease progression are hampered by a lack of tools. In this study, we have generated monoclonal antibodies to N. fowleri surface antigens and shown them to be excellent tools for studying the in vivo immune response. We also identified one monoclonal, 2B6, with potent inherent anti-amoebastatic activity in vitro . This antibody is also able to therapeutically prolong host survival in vivo and furthermore, recombinant antibodies with an isotype more capable of directing immune effector activity further improved survival when given therapeutically. Thus, we report the generation of a novel monoclonal antibody to N. fowleri that can enhance beneficial immune functions, even when given therapeutically during disease. We believe this provides evidence for the potential of therapeutic antibody treatments in PAM. IMPORTANCE Naegleria fowleri ( N. fowleri ) is a free-living amoeba that is found ubiquitously in warm freshwater. While human exposure is common, it rarely results in pathogenesis. However, when N. fowleri gains access to the upper airway, specifically the olfactory mucosa, infection leads to a lethal disease known as primary amoebic meningoencephalitis (PAM). As a free-living amoeba, N. fowleri does not need a mammalian host; indeed, it can be accurately described as an accidental opportunistic pathogen. While most opportunistic infections occur in humans who are immunocompromised, there are no reported immune dysfunctions associated with N. fowleri infection. Therefore, the basis for N. fowleri opportunism is not known, and the reasons why some humans develop PAM while others do not are simply not well understood. It is reasonable to speculate that local or acute immune failures, potentially even a lack of prior adaptive immunity, are related to disease susceptibility. Careful immune profiling and characterization of the in vivo immune response to N. fowleri in a mammalian host are desperately needed to understand which host factors are critical to defense, and how these responses might be compromised in a way that results in lethal infection. To identify genes and pathways that provide resistance against in vivo N. fowleri infection, we generated surface reactive monoclonal antibodies (Abs) that provide rapid amoeba detection and quantification in vivo . Interestingly, N. fowleri binding Abs have been readily detected in the serum and saliva of humans and animals suggesting that non-lethal exposure drives a humoral immune response against the amoeba. Yet, how Abs might interact with Naegleria in vivo or contribute to preventing lethal infection is not well understood. In this study, we have generated and characterized a monoclonal antibody (Ab), Clone 2B6, that recognizes a glycosylated surface antigen present in cultured in vitro N. fowleri as well as mouse passaged N. fowleri . When clone 2B6 binds to N. fowleri , it inhibits amoeba motility and feeding behavior, leading to strong growth inhibition. Mice treated systemically and intracerebrally with Ab displayed a delayed disease onset and prolonged survival. In addition, we found that enhancing immune-directed effector activity via antibody isotype could further enhance survival without obvious immunopathogenic side effects. These findings show the potential for antibody treatment as an additional therapeutic to those used currently in PAM.