Toxoplasma gondii is a foodborne pathogen that can cause severe and life-threatening infections in fetuses and immunocompromised patients. Felids are its only definitive hosts, and a wide range of animals, including humans, serve as intermediate hosts. When the transmissible bradyzoite stage is orally ingested by felids, they transform into merozoites that expand asexually, ultimately generating millions of gametes for the parasite sexual cycle. However, bradyzoites in intermediate hosts differentiate exclusively to disease-causing tachyzoites, which rapidly disseminate throughout the host. Though tachyzoites are well-studied, the molecular mechanisms governing transitioning between developmental stages are poorly understood. Each parasite stage can be distinguished by a characteristic transcriptional signature, with one signature being repressed during the other stages. Switching between stages require substantial changes in the proteome, which is achieved in part by ubiquitination. F-box proteins mediate protein poly-ubiquitination by recruiting substrates to SKP1, Cullin-1, F-Box protein E3 ubiquitin ligase (SCF-E3) complexes. We have identified an F-box protein named Toxoplasma gondii F-Box Protein L2 (TgFBXL2), which localizes to distinct perinucleolar sites. TgFBXL2 is stably engaged in an SCF-E3 complex that is surprisingly also associated with a COP9 signalosome complex that negatively regulates SCF-E3 function. At the cellular level, TgFBXL2-depleted parasites are severely defective in centrosome replication and daughter cell development. Most remarkable, RNAseq data show that TgFBXL2 conditional depletion induces the expression of stage-specific genes including a large cohort of genes necessary for sexual commitment. Together, these data suggest that TgFBXL2 is a latent guardian of stage specific gene expression in Toxoplasma and poised to remove conflicting proteins in response to an unknown trigger of development.

As Toxoplasma gondii disseminates through its host, the parasite must sense and adapt to its environment and scavenge nutrients. Oxygen (O 2 ) is one such environmental factor and cytoplasmic prolyl 4-hydroxylases (PHDs) are evolutionarily conserved O 2 cellular sensing proteins that regulate responses to changes in O 2 availability. Toxoplasma expresses 2 PHDs. One of them, TgPHYa hydroxylates SKP1, a subunit of the SCF-E3 ubiquitin ligase complex. In vitro, TgPHYa is important for growth at low O 2 levels. However, studies have yet to examine the role that TgPHYa or any other pathogen-encoded PHD plays in virulence and disease. Using a type II ME49 Toxoplasma TgPHYa knockout, we report that TgPHYa is important for Toxoplasma virulence and brain cyst formation in mice. We further find that while TgPHYa mutant parasites can establish an infection in the gut, they are unable to efficiently disseminate to peripheral tissues because the mutant parasites are unable to survive within recruited immune cells. Since this phenotype was abrogated in IFNγ knockout mice, we studied how TgPHYa mediates survival in IFNγ-treated cells. We find that TgPHYa is not required for release of parasite-encoded effectors into host cells that neutralize anti-parasitic processes induced by IFNγ. In contrast, we find that TgPHYa is required for the parasite to scavenge tryptophan, which is an amino acid whose levels are decreased after IFNγ up-regulates the tryptophan-catabolizing enzyme, indoleamine dioxygenase (IDO). We further find, relative to wild-type mice, that IDO knockout mice display increased morbidity when infected with TgPHYa knockout parasites. Together, these data identify the first parasite mechanism for evading IFNγ-induced nutritional immunity and highlight a novel role that oxygen-sensing proteins play in pathogen growth and virulence.

Parafusin is a phosphoglucomutase (PGM) paralog that acts as a signaling scaffold protein in calcium mediated exocytosis across many eukaryotes. In Toxoplasma gondii the parafusin related protein 1 (PRP1) has been associated in indirect and heterologous studies with the regulated exocytosis of the micronemes, which are required for successful host cell invasion and egress. Here we directly assessed the role of PRP1 by deleting the gene from the parasite. We observed a specific defect in microneme secretion in response to high Ca2+ fluxes, but not to phosphatidic acid fluxes controlling microneme release. We observed no defect in constitutive microneme secretion which was sufficient to support completion of the lytic cycle. Furthermore, deletion of the other PGM in Toxoplasma, PGM2, as well as the double PRP1/PGM2 deletion resulted in a similar phenotype. This suggests a functional interaction between these two genes. Strikingly, tachyzoites without both paralogs are completely viable in vitro and during acute mice infections. This indicates that PGM activity is neither required for glycolysis. In conclusion, the PRP1-PGM2 pair is required for a burst in microneme secretion upon high Ca2+ fluxes, but this burst is not essential to complete the lytic cycle of the parasite.

Hypoxia Inducible Factor-1 is a metazoan heterodimeric transcription factor that senses changes in O2 levels. HIF-1α subunit abundance is post-translationally regulated by prolyl-hydroxylase domain enzymes (PHDs), which use molecular O2 and α-ketoglutarate to hydroxylate two prolyl-residues in HIF-1α. Three PHDs have been identified and PHD2 is the most critical regulator of HIF-1α. HIF-1α can also be activated independently of hypoxia and in some cases this is due to changes in PHD2 abundance through poorly understood mechanisms. Previously, we reported that under O2-replete conditions that the intracellular parasite Toxoplasma gondii activates HIF-1 by reducing PHD2 protein abundance. Here, we demonstrate that Toxoplasma regulates PHD2 through a multistep process. First, PHD2 is a nucleocytoplasmic protein and Toxoplasma induces PHD2 cytoplasmic accumulation to separate it from nuclear HIF-1α. PHD2 is then degraded by lysosomes independently of the major autophagic processes, macroautophagy or chaperone-mediated autophagy. Rather, PHD2 interacts with the major lysosomal membrane protein, LAMP1, which is required for HIF-1 activation. These data therefore highlight for the first time that cytoplasmic trapping and subsequent lysosomal degradation of a host nucleocytoplasmic protein is a mechanism used by a microbial pathogen to regulate host gene expression.

By binding to the adaptor protein SKP1 and serving as substrate receptors for the Skp1, Cullin, F-box E3 ubiquitin ligase complex, F-box proteins regulate critical cellular processes including cell cycle progression and membrane trafficking. While F-box proteins are conserved throughout eukaryotes and are well studied in yeast, plants, and animals, studies in parasitic protozoa are lagging. We have identified eighteen putative F-box proteins in the Toxoplasma genome of which four have predicted homologs in Plasmodium . Two of the conserved F-box proteins were demonstrated to be important for Toxoplasma fitness and here we focus on an F-box protein, named TgFBXO1, because it is the most highly expressed by replicative tachyzoites and was also identified in an interactome screen as a Toxoplasma SKP1 binding protein. TgFBXO1 interacts with Toxoplasma SKP1 confirming it as a bona fide F-box protein. In interphase parasites, TgFBXO1 is a component of the Inner Membrane Complex (IMC), which is an organelle that underlies the plasma membrane. Early during replication, TgFBXO1 localizes to the developing daughter cell scaffold, which is the site where the daughter cell IMC and microtubules form and extend from. TgFBXO1 localization to the daughter cell scaffold required centrosome duplication but occurred before segregation of the centrocone, which connects the spindle pole to the centrosomes. Daughter cell scaffold localization required TgFBXO1 N-myristoylation and was dependent on the small molecular weight GTPase, TgRab11b. Finally, we demonstrate that TgFBXO1 is required for parasite growth due to its function as a daughter cell scaffold effector. TgFBXO1 is the first F-box protein to be studied in apicomplexan parasites and represents the first protein demonstrated to be important for daughter cell scaffold function.AUTHOR SUMMARY Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that can cause devastating and life-threatening disease in immunocompromised patients and in fetuses. Its replication is important to study because parasite growth is responsible for the pathology that develops in toxoplasmosis patients. The parasite replicates by a unique process named endodyogeny in which two daughter parasites develop within the mother cell. Early during this process the parasite creates a structure called the Daughter Cell Scaffold whose function is to mark the site from which daughter parasites will emerge. Here, we report the identification of one of the first proteins recruited to the Daughter Cell Scaffold and its importance in executing its function.

Infection and inflammation within the brain induces changes in neuronal connectivity and function. The intracellular protozoan parasite, Toxoplasma gondii , is one pathogen that infects the brain and can cause encephalitis and seizures. Persistent infection by this parasite is also associated with behavioral alterations and an increased risk for developing psychiatric illness, including schizophrenia. Current evidence from studies in humans and mouse models suggest that both seizures and schizophrenia result from a loss or dysfunction of inhibitory synapses. In line with this, we recently reported that persistent Toxoplasma gondii infection alters the distribution of glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67), an enzyme that catalyzes GABA synthesis in inhibitory synapses. These changes could reflect a redistribution of presynaptic machinery in inhibitory neurons or a loss of inhibitory nerve terminals. To directly assess the latter possibility, we employed serial block face scanning electron microscopy (SBFSEM) and quantified inhibitory perisomatic synapses in neocortex and hippocampus following parasitic infection. Not only did persistent infection lead to a significant loss of perisomatic synapses, it induced the ensheathment of neuronal somata by phagocytic cells. Immunohistochemical, genetic, and ultrastructural analyses revealed that these phagocytic cells included reactive microglia. Finally, ultrastructural analysis identified phagocytic cells enveloping perisomatic nerve terminals, suggesting they may participate in synaptic stripping. Thus, these results suggest that microglia contribute to perisomatic inhibitory synapse loss following parasitic infection and offer a novel mechanism as to how persistent Toxoplasma gondii infection may contribute to both seizures and psychiatric illness.

Abstract The apicomplexan parasite Toxoplasma gondii has developed mechanisms to establish a central nervous system infection in virtually all warm-blooded animals. Acute T. gondii infection can cause neuroinflammation, encephalitis, and seizures. Meanwhile, studies in humans, non-human primates, and rodents have linked chronic T. gondii infection with altered behavior and increased risk for neuropsychiatric disorders, including schizophrenia. We previously demonstrated that T. gondii infection triggers the loss of perisomatic inhibitory synapses, an important source of inhibition on excitatory pyramidal cells, and a type of synapse that is disrupted in neurological and neuropsychiatric disorders. Similar to other instances of inflammation and neurodegeneration, we showed that phagocytic cells (including microglia and infiltrating monocytes) contribute to the loss of these inhibitory synapses. However, in the case of T. gondii -induced synapse loss, phagocytic cells target and ensheath the cell bodies of telencephalic neurons. Here, we show that these phagocytic cells specifically ensheath excitatory pyramidal neurons, leading to the preferential loss of perisomatic synapses on these neurons. In contrast, inhibitory cortical interneuron subtypes are not extensively ensheathed by phagocytic cells following infection. Moreover, we show that infection induces expression of complement C3 protein by these excitatory neurons and that C3 is required for the loss of perisomatic inhibitory synapses, albeit not through activation of the classical complement pathway. Together, these findings provide evidence that T. gondii infection induces changes in excitatory pyramidal neurons that trigger selective removal of inhibitory perisomatic synapses in the infected neocortex and provide a novel role for complement in remodeling of inhibitory circuits in the infected brain.

ABSTRACT Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite whose tachyzoite form causes disease via a lytic growth cycle. Its metabolic and cellular pathways are primarily designed to ensure parasite survival within a host cell. But during its lytic cycle tachyzoites are exposed to the extracellular milieu and prolonged exposure requires activation of stress response pathways that include reprogramming the parasite proteome. Regulation of protein synthesis is therefore important for extracellular survival. We previously reported that in extracellularly stressed parasites that the elongation phase of protein synthesis is negatively regulated by the Toxoplasma oxygen sensing protein, PhyB. PhyB acts by promoting the activity of elongation factor eEF2, which is a GTPase that catalyzes the transfer of the peptidyl-tRNA from the A site to the P site of the ribosome. In the absence of PhyB, eEF2 is hyper-phosphorylated, which inhibits eEF2 from interacting with the ribosome. eEF2 kinases are atypical calcium-dependent kinases and BLAST analyses revealed the parasite kinase, CDPK3, as the most highly homologous to the Saccharomyces cerevisiae eEF2 kinase, RCK2 . In parasites exposed to extracellular stress, loss of CDPK3 leads to decreased eEF2 phosphorylation and enhanced rates of elongation. Furthermore, co-immunoprecipitation studies revealed that CDPK3 and eEF2 interact in stressed parasites. Since CDPK3 and eEF2 normally localize to the plasma membrane and cytosol, respectively, we investigated how the two can interact. We report that under stress conditions that CDPK3 is not N-myristoylated likely leading to its cytoplasmic localization. In summary, we have identified a novel function for CDPK3 as the first protozoan extracellular-stress induced eEF2 kinase. IMPORTANCE Here, we identify the first protozoan kinase that phosphorylate elongation factor 2 and demonstrate that it is part of an integrated stress response.

ABSTRACT Toxoplasma gondii is a foodborne pathogen that can cause severe and life-threatening infections in fetuses and immunocompromised patients. Felids are its only definitive hosts, and a wide range of animals, including humans, serve as intermediate hosts. When the transmissible bradyzoite stage is orally ingested by felids, they transform into merozoites that expand asexually, ultimately generating millions of gametes for the parasite sexual cycle. However, bradyzoites in intermediate hosts differentiate exclusively to disease-causing tachyzoites, which rapidly disseminate throughout the host. Though tachyzoites are well-studied, the molecular mechanisms governing transitioning between developmental stages are poorly understood. Each parasite stage can be distinguished by a characteristic transcriptional signature, with one signature being repressed during the other stages. Switching between stages requires substantial changes in the proteome, which is achieved in part by ubiquitination. F-box proteins mediate protein poly-ubiquitination by recruiting substrates to SKP1, Cullin-1, F-Box protein E3 ubiquitin ligase (SCF-E3) complexes. We have identified an F-box protein named Toxoplasma gondii F-Box Protein L2 (TgFBXL2), which localizes to distinct nuclear sites. TgFBXL2 is stably engaged in an SCF-E3 complex that is surprisingly also associated with a COP9 signalosome complex that negatively regulates SCF-E3 function. At the cellular level, TgFBXL2-depleted parasites are severely defective in centrosome replication and daughter cell development. Most remarkable, RNA seq data show that TgFBXL2 conditional depletion induces the expression of genes necessary for sexual commitment. We suggest that TgFBXL2 is a latent guardian of sexual stage development in Toxoplasma and poised to remove conflicting proteins in response to an unknown trigger of sexual development. AUTHOR SUMMARY Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that replicates sexually in felids and asexually in nearly all other mammals with each life stage having a specific transcriptional profile. When life stage specific transcription is not properly controlled, the parasite dies and therefore it’s important to understand what inhibits expression of sexual stage genes during asexual growth and vice versa. Here we identify a ubiquitin E3 ligase complex that inhibits sexual stage gene expression during asexual growth.

Abstract As Toxoplasma gondii disseminates through its host, the parasite must sense and adapt to its environment and scavenge nutrients. Oxygen (O 2 ) is one such environmental factor and cytoplasmic prolyl 4-hydroxylases (PHDs) are evolutionarily conserved O 2 cellular sensing proteins that regulate responses to changes in O 2 availability. Toxoplasma expresses two PHDs. One of them, TgPHYa hydroxylates SKP1, a subunit of the SCF-E3 ubiquitin ligase complex. In vitro, TgPHYa is important for growth at low O 2 levels. However, studies have yet to examine the role that TgPHYa or any other pathogen encoded PHD plays in virulence and disease. Using a type II ME49 Toxoplasma TgPHYa knockout, we report that TgPHYa is important for Toxoplasma virulence and brain cyst formation in mice. We further find that while TgPHYa mutant parasites can establish an infection in the gut they are unable to efficiently disseminate to peripheral tissues because the mutant parasites are unable to survive within recruited immune cells. Since this phenotype abrogated in IFNγ knockout mice, we studied how TgPHYa mediates survival in IFNγ-treated cells. We find that TgPHYa is not required for release of parasite-encoded effectors into host cells that neutralize anti-parasitic processes induced by IFNγ. In contrast, we find that TgPHYa is required for the parasite to scavenge tryptophan, which is an amino acid whose levels are decreased after IFNγ upregulates the tryptophan-catabolizing enzyme, indoleamine dioxygenase (IDO). We further find that relative to wild-type mice that IDO knockout mice display increased morbidity when infected with TgPHYa knockout parasites. Together, these data identify the first parasite mechanism for evading IFNγ-induced nutritional immunity and highlight a novel role that oxygen sensing proteins play in pathogen growth and virulence.