Recent sequencing projects have provided deep insight into fungal lifestyle-associated genomic adaptations. Here we report on the 25 Mb genome of the mutualistic root symbiont Piriformospora indica (Sebacinales, Basidiomycota) and provide a global characterization of fungal transcriptional responses associated with the colonization of living and dead barley roots. Extensive comparative analysis of the P. indica genome with other Basidiomycota and Ascomycota fungi that have diverse lifestyle strategies identified features typically associated with both, biotrophism and saprotrophism. The tightly controlled expression of the lifestyle-associated gene sets during the onset of the symbiosis, revealed by microarray analysis, argues for a biphasic root colonization strategy of P. indica. This is supported by a cytological study that shows an early biotrophic growth followed by a cell death-associated phase. About 10% of the fungal genes induced during the biotrophic colonization encoded putative small secreted proteins (SSP), including several lectin-like proteins and members of a P. indica-specific gene family (DELD) with a conserved novel seven-amino acids motif at the C-terminus. Similar to effectors found in other filamentous organisms, the occurrence of the DELDs correlated with the presence of transposable elements in gene-poor repeat-rich regions of the genome. This is the first in depth genomic study describing a mutualistic symbiont with a biphasic lifestyle. Our findings provide a significant advance in understanding development of biotrophic plant symbionts and suggest a series of incremental shifts along the continuum from saprotrophy towards biotrophy in the evolution of mycorrhizal association from decomposer fungi.

Summary The intracellular colonization of plant roots by the beneficial fungal endophyte Serendipita indica follows a biphasic strategy. After an early biotrophic phase, the interaction transitions to a host cell death phase restricted to the epidermal and cortex layers of the root. Host cell death contributes to the successful accommodation of the fungus during the beneficial interaction in Arabidopsis thaliana . How host cell death is initiated and controlled is largely unknown. Here we show that two fungal enzymes, the ecto-5’-nucleotidase Si E5NT and the nuclease Si NucA, act synergistically in the plant apoplast at the onset of cell death to produce deoxyadenosine (dAdo), a potent cell death inducer in animal systems. The uptake of extracellular dAdo, but not the structurally related adenosine (Ado), activates a previously undescribed cell death mechanism in A. thaliana . Mutation of the equilibrative nucleoside transporter ENT3 in A. thaliana results in resistance to cell death triggered by extracellular dAdo and reduced fungal-mediated cell death during root colonization. A library screen of A. thaliana T-DNA insertion lines identified a toll/interleukin-1 receptor nucleotide-binding leucine-rich repeat (TIR-NLR) protein as an additional intracellular component in dAdo-triggered cell death. Mutation of this previously uncharacterised TIR-NLR, which we have named ISI ( i nduced by S . i ndica ), affects host cell death, fungal colonization and growth promotion, suggesting a key role in the regulation of root cell death and plant-microbe interaction. Our data show that the combined activity of two fungal apoplastic enzymes leads to the production of a metabolite that, upon uptake, triggers TIR-NLR-modulated plant cell death, providing a link to immunometabolism in plants. Short summary Efficient intraradical colonization by the beneficial fungal endophyte Serendipita indica requires restricted host cell death. How this symbiotic host cell death is initiated and controlled is largely unknown. Here we show that two fungal enzymes, the ecto-5’-nucleotidase Si E5NT and the nuclease Si NucA, act synergistically in the apoplast at the onset of cell death to produce deoxyadenosine (dAdo), a potent cell death inducer in animal systems. Uptake of extracellular dAdo activates a previously undescribed cell death mechanism in plants. Mutation of the A. thaliana equilibrative nucleoside transporter ENT3 leads to resistance to cell death triggered by uptake of extracellular dAdo and to reduced fungal-mediated cell death during colonization. A library screen of A. thaliana T-DNA insertion lines identified a TIR-NLR protein as an additional intracellular component in dAdo-triggered cell death, providing a link to immunometabolism in plants. In a nutshell Regulated host cell death is part of the plant defense strategy against pathogens, but it is also involved in the accommodation of certain beneficial microbes in the roots. We have identified extracellular metabolites and intracellular metabolic signals that contribute to colonization by beneficial root fungal endophytes and uncovered a conserved cell death mechanism likely co-opted for establishing plant-endophyte symbiosis.

Abstract Plant root-associated bacteria can confer protection against pathogen infection. By contrast, the beneficial effects of root endophytic fungi and their synergistic interactions with bacteria remain poorly defined. We demonstrate that the combined action of a fungal root endophyte from a widespread taxon with core bacterial microbiota members provides synergistic protection against an aggressive soil-borne pathogen in Arabidopsis thaliana and barley. We additionally show early inter-kingdom growth promotion benefits which are host and microbiota composition dependent. Highlights The root endophytic fungus Serendipita vermifera can functionally replace core bacterial microbiota members in mitigating pathogen infection and disease symptoms. S. vermifera additionally stabilizes and potentiates the protective activities of root-associated bacteria and mitigates the negative effects of a non-native bacterial community in A. thaliana . Inter-kingdom synergistic beneficial effects do not require extensive host transcriptional reprogramming nor high levels of S. vermifera colonisation. Inter-kingdom protective benefits are largely independent of the host while synergism leading to early inter-kingdom growth promotion is driven by host species and microbiota composition.

Associations between plants and beneficial root-endophytic fungi enhance plant performance by improving nutrient uptake, abiotic stress tolerance and disease resistance. To successfully colonize different host plants and defend their host niche against competing microbes, but also to cooperate with beneficial bacterial members of the microbiota, root endophytes such as Sebacinales secrete a multitude of tightly regulated effector-proteins and carbohydrate-active enzymes. However, the functions, specificity, and regulation of these proteins remain poorly understood. In this study, we employ time-resolved transcriptomics to analyse the gene expression profiles of two Sebacinales members interacting with organisms from different kingdoms of life. We identified crucial genes for plant colonization and intermicrobial competition, including a fungal GH18-CBM5 chitinase specifically upregulated in response to the phytopathogenic fungus Bipolaris sorokiniana. This chitinase protects the plant hosts against the pathogen, reducing fungal biomass and disease symptoms in barley and Arabidopsis thaliana. Our findings shed light on interaction partner specific gene expression in Sebacinales endophytes, with potential applications in enhancing plant health and resilience.

Abstract Endophytic root colonisation of the host plant Arabidopsis thaliana by the beneficial root endophyte Serendipita indica is characterised by an initial biotrophic phase followed by a restricted host cell death-associated phase. During colonisation two secreted S. indica effectors synergistically produce the cell death inducer deoxyadenosine (dAdo). Although the mechanism of regulated cell death is important for fungal accommodation, the host molecular pathways that restrict S. indica -induced cell death and allow the maintenance of a mutualistic relationship are largely unknown. Here we show that autophagy, a major degradation pathway plays a key role in the beneficial interaction between S. indica and Arabidopsis. Autophagy restricts fungal colonisation and exerts a protective function against dAdo-induced cell death. Impairment of dAdo uptake in an autophagy mutant background confers resistance to dAdo-induced cell death and precludes the symbiosis-mediated cell death. Taken together, we propose that autophagy-driven pro-survival responses are required to facilitate a long-lasting mutualistic interaction between S. indica and Arabidopsis.

Extracellular adenosine 5′-triphosphate (eATP) is an essential signaling molecule that mediates different cellular processes through its interaction with membrane-associated receptor proteins in animals and plants. eATP regulates plant growth, development and responses to biotic and abiotic stresses. Its accumulation in the apoplast induces ROS production and cytoplasmic calcium increase mediating a defense response to invading microbes. We demonstrate that perception of eATP is important in plant-fungus interactions and that during colonization by the beneficial root endophyte Serendipita indica accumulation of eATP in the apoplast occurs at early symbiotic stages. We show by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, cytological and functional analysis that S. indica subvert eATP host response by secreting SiE5'NT, an enzymatically active ecto-5'-nucleotidase capable of hydrolyzing eATP to adenosine. A. thaliana lines producing extracellular SiE5'NT are significantly better colonized and have reduced eATP levels and defense signaling, indicating that SiE5'NT functions as a compatibility factor. Our data show that extracellular bioactive nucleotides play an important role in fungus-root interactions and that fungi can modify plant derived metabolites in the apoplast to modulate host immunity.