Clearance of serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) from the synaptic cleft after neuronal signaling is mediated by serotonin transporter SERT, which couples this process to the movement of a Na + ion down its chemical gradient. After release of 5-HT and Na + into the cytoplasm, the transporter faces a rate-limiting challenge of resetting its conformation to be primed again for 5-HT and Na + binding. Early studies of vesicles containing native SERT revealed that K + gradients can provide an additional driving force, via K + antiport. Moreover, under appropriate conditions, a H + ion can replace K + . Intracellular K + accelerates the resetting step. Structural studies of SERT have identified two binding sites for Na + ions, but the K + site remains enigmatic. Here, we show that K + antiport can drive substrate accumulation into vesicles containing SERT extracted from a heterologous expression system, allowing us to study the residues responsible for K + binding. To identify candidate binding residues, we examine many cation binding configurations using molecular dynamics simulations, predicting that K + binds to the so-called Na 2+ site. Site directed mutagenesis of residues in this site can eliminate the ability of both K + and H + to drive 5-HT accumulation into vesicles and, in patch clamp recordings, prevent the acceleration of turnover rates and the formation of a channel-like state by K + or H + . In conclusion, the Na 2+ site plays a pivotal role in orchestrating the sequential binding of Na + and then K + (or H + ) ions to facilitate 5-HT uptake in SERT.

Abstract The concentrative power of the transporters for dopamine (DAT), norepinephrine (NET) and serotonin (SERT) is thought to be fueled by the transmembrane Na + gradient, but it is conceivable that they can also tap other energy sources, e.g. membrane voltage and/or the transmembrane K + gradient. We address this by recording uptake of endogenous substrates or the fluorescent substrate APP + ((4-(4-dimethylamino)phenyl-1-methylpyridinium) under voltage control in cells expressing DAT, NET or SERT. We show that DAT and NET differ from SERT in intracellular handling of K + . In DAT and NET, substrate uptake was voltage-dependent due to the transient nature of intracellular K + binding, which precluded K + antiport. SERT, however, antiports K + and achieves voltage-independent transport. Thus, there is a trade-off between maintaining constant uptake and harvesting membrane potential for concentrative power, which we conclude to occur due to subtle differences in the kinetics of co-substrate ion binding in closely related transporters.

Biological membranes carry fixed charges at their surfaces. These arise primarily from phospholipid head groups. In addition, membrane proteins contribute to the surface potential with their charged residues. Membrane lipids are asymmetrically distributed. Because of this asymmetry the net negative charge at the inner leaflet exceeds that at the outer leaflet. Changes in surface potential are predicted to shape the capacitive properties of the membrane (i.e. the ability of the membrane to store electrical charges). Here, we show that it is possible to detect changes in surface potential by an electrophysiological approach: the analysis of cellular currents relies on assuming that the electrical properties of a cell are faithfully described by a three-element circuit - i.e. the minimal equivalent circuit - comprised of two resistors and one capacitor. However, to account for changes in surface potential it is necessary to add a battery to this circuit connected in series with the capacitor. This extended circuit model predicts that the current response to a square-wave voltage pulse harbors information, which allows for separating the changes in surface potential from a true capacitance change. We interrogated our model by investigating changes in capacitance induced by ligand binding to the serotonin transporter (SERT) and to the glycine transporters (GlyT1 and GlyT2). The experimental observations were consistent with the predictions of the extended circuit. We conclude that ligand-induced changes in surface potential (reflecting the binding event) and in true membrane capacitance (reflecting the concomitant conformational change) can be detected in real time even in instances where they occur simultaneously.

Electrophysiological recordings allow for monitoring the operation of proteins with high temporal resolution down to the single molecule level. This technique has been exploited to track either ion flow arising from channel opening or the synchronized movement of charged residues and/or ions within the membrane electric field. Here, we describe a novel type of current by using the serotonin transporter (SERT) as a model. We examined transient currents elicited on rapid application of specific SERT inhibitors. Our analysis shows that these currents originate from ligand binding and not from a conformational change. The Gouy-Chapman model predicts that a ligand-induced elimination/neutralization of surface charge must produce a displacement current and related apparent changes in membrane capacitance. Here we verified these predictions with SERT. Our observations demonstrate that ligand binding to a protein can be monitored in real time and in a label-free manner by recording the membrane capacitance.

Abstract The serotonin transporter (SERT/SLC6A4) is arguably the most extensively studied solute carrier (SLC). During its eponymous action - i.e., the retrieval of serotonin from the extracellular space - SERT undergoes a conformational cycle. Typical inhibitors (antidepressant drugs and cocaine), partial and full substrates (amphetamines and their derivatives) and atypical inhibitors (ibogaine analogues) bind preferentially to different states in this cycle. This results in competitive or non-competitive transport inhibition. Here, we explored the action of N-formyl-1,3-bis (3,4-methylenedioxyphenyl)-prop-2-yl-amine (ECSI#6) on SERT: inhibition of serotonin uptake by ECSI#6 was enhanced with increasing serotonin concentration. Conversely, the K M for serotonin was lowered by augmenting ECSI#6. ECSI#6 bound with low affinity to the outward-facing state of SERT but with increased affinity to a potassium-bound state. Electrophysiological recordings showed that ECSI#6 preferentially interacted with the inward-facing state. Kinetic modeling recapitulated the experimental data and verified that uncompetitive inhibition arose from preferential binding of ECSI#6 to the K + -bound, inward-facing conformation of SERT. This binding mode predicted a pharmacochaperoning action of ECSI#6, which was confirmed by examining its effect on the folding-deficient mutant SERT-PG 601,602 AA: pre-incubation of HEK293 cells with ECSI#6 restored export of SERT-PG 601,602 AA from the endoplasmic reticulum and substrate transport. Similarly, in transgenic flies, administration of ECSI#6 promoted delivery of SERT-PG 601,602 AA to the presynaptic specialization of serotonergic neurons. To the best of our knowledge, ECSI#6 is the first example of an uncompetitive SLC inhibitor. Pharmacochaperones endowed with the binding mode of ECSI#6 are attractive, because they can rescue misfolded transporters at concentrations, which cause modest transport inhibition.

Abstract The dopamine transporter (DAT) retrieves dopamine into presynaptic terminals after synaptic release. The concentrative power of DAT is thought to be fueled by the transmembrane Na + gradient, but it is conceivable that DAT can also rely on other energy sources, e.g. membrane voltage and/or the K + gradient. Here, we recorded uptake of dopamine or the fluorescent substrate APP + ((4-(4-dimethylamino)phenyl-1-methylpyridinium) in DAT-expressing cells under voltage control. We show that DAT differs substantially from the closely related serotonin transporter (SERT): substrate uptake by DAT was voltage-dependent, intracellular K + binding to DAT was electrogenic but transient in nature thus precluding antiport of K + by DAT. There is a trade-off between maintaining constant uptake and harvesting membrane potential for concentrative power. Based on our observations, we conclude that subtle differences in the kinetics of co-substrate ion binding allow closely related transporters to select between voltage-independent uptake and high concentrative power.

The creatine transporter-1 (CRT-1/SLC6A8) maintains the uphill transport of creatine into cells against a steep concentration gradient. Cellular creatine accumulation is required to support the ATP-buffering by phosphocreatine. More than 60 compounds have been explored in the past for their ability to inhibit cellular creatine uptake, but the number of active compounds is very limited. Here, we show that all currently known inhibitors are full alternative substrates. We analyzed their structure-activity relation for inhibition of CRT-1 to guide a rational approach to the synthesis of novel creatine transporter ligands. Measurements of both, inhibition of [