A unified understanding of >390 Myr of insect evolution requires insight into their origin. Molecular clocks are widely applied for evolutionary dating, but clocks for the class Insecta have remained elusive. We now define a robust nucleotide and amino acid mitochondrial molecular clock encompassing five insect orders, including the Blattaria (cockroaches), Orthoptera (crickets and locusts), Hemiptera (true bugs), Diptera, and Lepidoptera (butterflies and moths). Calibration of the clock using one of the earliest, most extensive fossil records for insects (the early ancestors of extant Blattaria) was congruent with all available insect fossils, with biogeographic history, with the Cambrian explosion, and with independent dating estimates from Lepidopteran families. In addition, dates obtained from both nucleotide and amino acid clocks were congruent with each other. Of particular interest to vector biology is the early date of the emergence of triatomine bugs (99.8-93.5 MYA), coincident with the formation of the South American continent during the breakup of Gondwanaland. More generally, we reveal the insects arising from a common ancestor with the Anostraca (fairy shrimps) at around the Silurian-Ordovician boundary (434.2-421.1 MYA) coinciding with the earliest plant megafossil. We explore Tilyard's theory proposing that the terrestrial transition of the aquatic arthropod ancestor to the insects is associated with a particular plant group (early vascular plants). The major output of the study is a comprehensive series of dates for deep-branching points within insect evolution that can act as calibration points for further dating studies within insect families and genera.

Leishmaniasis is a geographically widespread severe disease, with an increasing incidence of two million cases per year and 350 million people from 88 countries at risk. The causative agents are species of Leishmania, a protozoan flagellate. Visceral leishmaniasis, the most severe form of the disease, lethal if untreated, is caused by species of the Leishmania donovani complex. These species are morphologically indistinguishable but have been identified by molecular methods, predominantly multilocus enzyme electrophoresis. We have conducted a multifactorial genetic analysis that includes DNA sequences of protein-coding genes as well as noncoding segments, microsatellites, restriction-fragment length polymorphisms, and randomly amplified polymorphic DNAs, for a total of approximately 18,000 characters for each of 25 geographically representative strains. Genotype is strongly correlated with geographical (continental) origin, but not with current taxonomy or clinical outcome. We propose a new taxonomy, in which Leishmania infantum and L. donovani are the only recognized species of the L. donovani complex, and we present an evolutionary hypothesis for the origin and dispersal of the species. The genus Leishmania may have originated in South America, but diversified after migration into Asia. L. donovani and L. infantum diverged approximately 1 Mya, with further divergence of infraspecific genetic groups between 0.4 and 0.8 Mya. The prevailing mode of reproduction is clonal, but there is evidence of genetic exchange between strains, particularly in Africa.

Culture forms of 17 Trypanosoma cruzi stocks∗, primarily isolated from a rural area of endemic Chagas' disease at São Felipe, Bahia, Brazil, were compared by the electrophoretic patterns of six enzymes: aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase (decarboxylating) (NADP+), glucosephosphate isomerase and phosphoglucomutase. Two markedly distinct combinations of isoenzyme patterns were seen, justifying the arrangement of the 17 stocks into two strain-groups, each of which was enzymically homogeneous. One combination was characteristic of the 11 domestic stocks of T. cruzi derived from both human infections and domiciliated animals; the second was characteristic of the six sylvatic stocks derived from opossums and a sylvatic triatomine species. The enzyme patterns were independent of the original host and the type of culture medium used. Distinction of the two strain-groups accords with epidemiological evidence that the domestic and sylvatic transmission cycles in São Felipe do not overlap. It is suggested that the diverse enzyme characters of the two strain-groups circulating in São Felipe reflect diverse origins; the domestic form of T. cruzi probably invaded the area from the south of Brazil with the domestic triatomine vector, Panstrongylus megistus.

ABSTRACT Trypanosoma cruzi , a zoonotic kinetoplastid protozoan with a complex genome, is the causative agent of American trypanosomiasis (Chagas disease). The parasite uses a highly diverse repertoire of surface molecules, with roles in cell invasion, immune evasion and pathogenesis. Thus far, the genomic regions containing these genes have been impossible to resolve and it has been impossible to study the structure and function of the several thousand repetitive genes encoding the surface molecules of the parasite. We here present an improved genome assembly of a T. cruzi clade I (TcI) strain using high coverage PacBio single molecule sequencing, together with Illumina sequencing of 34 T. cruzi TcI isolates and clones from different geographic locations, sample sources and clinical outcomes. Resolution of the surface molecule gene structure reveals an unusual duality in the organisation of the parasite genome, a core genomic region syntenous with related protozoa flanked by unique and highly plastic subtelomeric regions encoding surface antigens. The presence of abundant interspersed retrotransposons in the subtelomeres suggests that these elements are involved in a recombination mechanism for the generation of antigenic variation and evasion of the host immune response. The comparative genomic analysis of the cohort of TcI strains revealed multiple cases of such recombination events involving surface molecule genes and has provided new insights into T. cruzi population structure.

Abstract Genetic exchange and hybridization in parasitic organisms is fundamental to the exploitation of new hosts and host populations. Variable mating frequency often coincides with strong metapopulation structure, where patchy selection or demography may favor different reproductive modes. Evidence for genetic exchange in Trypanosoma cruzi over the last 30 years has been limited and inconclusive. The reproductive modes of other medically important trypanosomatids are better established, although little is known about their variability on a spatio-temporal scale. Targeting a contemporary focus of T. cruzi transmission in southern Ecuador, we present compelling evidence from 45 sequenced genomes that T. cruzi (discrete typing unit I) maintains sexual populations alongside others that represent clonal bursts of parasexual origin. Strains from one site exhibit genome-wide Hardy-Weinberg equilibrium and intra-chromosomal linkage decay consistent with meiotic reproduction. Strains collected from adjacent areas (>6 km) show excess heterozygosity, near-identical haplo-segments, common mitochondrial sequences and levels of aneuploidy incompatible with Mendelian sex. Certain individuals exhibit trisomy in as many as fifteen chromosomes. Others present fewer, yet shared, aneuploidies reminiscent of mitotic genome erosion and parasexual genetic exchange. Genomic and intra-genomic phylogenetics as well as haplotype co-ancestry analyses indicate a clear break in gene-flow between these distinct populations, despite the fact that they occasionally co-occur in vectors and hosts. We propose biological explanations for the fine-scale disconnectivity we observe and discuss the epidemiological consequences of flexible reproductive modes and their genomic architecture for this medically important parasite.

Abstract Human infection with the intestinal nematode Strongyloides stercoralis is persistent unless effectively treated, and potentially fatal in immunosuppressed individuals. Epidemiological data are lacking due to inadequate diagnosis. A rapid antigen detection test is a priority for population surveillance, validating cure after treatment, and for screening prior to immunosuppression. We analysed open access ‘omics’ data sets and used online predictors to identify S. stercoralis proteins that are likely to be present in infected stool, Strongyloides-specific , and antigenic. Transcriptomic data from gut and non-gut dwelling life cycle stages of S. stercoralis revealed 328 proteins that are differentially expressed. Strongyloides ratti proteomic data for excreted and secreted (E/S) proteins were matched to S. stercoralis , giving 1,057 orthologues. Five parasitism-associated protein families (SCP/TAPS, prolyl oligopeptidase, transthyretin-like, aspartic peptidase, acetylcholinesterase) were compared phylogenetically between S. stercoralis and outgroups, and proteins with least homology to the outgroups were selected. Proteins that overlapped between the transcriptomic and proteomic datasets were analysed by multiple sequence alignment, epitope prediction and 3D structure modelling to reveal S. stercoralis candidate peptide/protein coproantigens. We describe 22 candidates from seven genes, across all five protein families for further investigation as potential S . stercoralis diagnostic coproantigens, identified using open access data and freely-available protein analysis tools. This powerful approach can be applied to many parasitic infections with ‘omic’ data to accelerate development of specific diagnostic assays for laboratory or point-of-care field application. Author summary The worm Strongyloides stercoralis causes infectious disease in people throughout tropical and sub-tropical regions, leading to an extensive reduction in quality of life and even death. Millions of people are at risk of infection with this parasite and improved diagnostic and control methods and technologies are urgently required. Currently, most diagnosis is carried out through methods involving visual inspection of patient’s faeces, which has a number of drawbacks, particularly its poor sensitivity. This paper presents a new method to develop improved diagnostic tests for S. stercoralis , by computational analysis of publicly available gene and protein sequences to predict proteins that may be detectable in faeces. This would enable the development of rapid diagnostic tests in the form of lateral flows or dipsticks, with better predictive ability and fewer drawbacks than current diagnostic methods. A number of potential proteins, predicted to have all the desired characteristics for use in such tests were found through the new method and have been presented in this paper. With validation, new diagnostic tests for S. stercoralis could be developed from these results and the computational approach could be used to target other parasitic diseases.

The tropical Andes is an important natural laboratory to understand speciation and diversification in many taxa. Here, we examined the evolutionary history of parasites of the Leishmania braziliensis species complex based on whole genome sequencing of 67 isolates from 47 localities in Peru. We firstly show the origin of near-clonal Andean Leishmania lineages that diverged from admixed Amazonian ancestors, accompanied by a significant reduction in genome diversity and large structural variations implicated in host-parasite interactions. Beside a clear dichotomy between Andean and Amazonian species, patterns of population structure were strongly associated with biogeographical origin. Molecular clock analyses and ecological niche modeling suggested that the history of diversification of the Andean lineages is limited to the Late Pleistocene and intimately associated with habitat contractions driven by climate change. These results support a wider model on trypanosomatid evolution where major parasite lineages emerge through ecological fitting. Second, genome-scale analyses provided evidence of meiotic recombination between Andean and Amazonian Leishmania species, resulting in full-genome hybrids. The mitochondrial genome of these hybrids consisted of homogeneous uniparental maxicircles, but minicircles originated from both parental species, leaving a mosaic ancestry of minicircle-encoded guide RNA genes. We further show that mitochondrial minicircles - but not maxicircles - show a similar evolutionary pattern as the nuclear genome, suggesting that biparental inheritance of minicircles is universal and may be important to alleviate maxicircle-nuclear incompatibilities. By comparing full nuclear and mitochondrial genome ancestries, our data expands our appreciation on the genetic consequences of diversification and hybridization in parasitic protozoa.

Protozoan parasites of the Leishmania donovani complex, L. donovani and L. infantum, cause the fatal disease visceral leishmaniasis. We present the first comprehensive genome-wide global study, with 151 cultured field isolates representing most of the geographical distribution. L. donovani isolates separated into five groups that largely coincide with geographical origin but vary greatly in diversity. In contrast, the majority of L. infantum samples fell into one globally-distributed group with little diversity. This picture is complicated by several hybrid lineages. Identified genetic groups vary in heterozygosity and levels of linkage, suggesting different recombination histories. We characterise chromosome-specific patterns of aneuploidy and identified extensive structural variation, including known and suspected drug resistance loci. This study reveals greater genetic diversity than suggested by geographically-focused studies, provides a resource of genomic variation for future work and sets the scene for a new understanding of the evolution and genetics of the Leishmania donovani complex.