Background Alternative splicing is the major post-transcriptional mechanism by which gene expression is regulated and affects a wide range of processes and responses in most eukaryotic organisms. RNA-sequencing (RNA-seq) can generate genome-wide quantification of individual transcript isoforms to identify changes in expression and alternative splicing. RNA-seq is an essential modern tool but its ability to accurately quantify transcript isoforms depends on the diversity, completeness and quality of the transcript information. Results We have developed a new Reference Transcript Dataset for Arabidopsis (AtRTD2) for RNA-seq analysis containing over 82k non-redundant transcripts, whereby 74,194 transcripts originate from 27,667 protein-coding genes. A total of 13,524 protein-coding genes have at least one alternatively spliced transcript in AtRTD2 such that about 60% of the 22,453 protein-coding, intron-containing genes in Arabidopsis undergo alternative splicing. More than 600 putative U12 introns were identified in more than 2,000 transcripts. AtRTD2 was generated from transcript assemblies of ca. 8.5 billion pairs of reads from 285 RNA-seq data sets obtained from 129 RNA-seq libraries and merged along with the previous version, AtRTD, and Araport11 transcript assemblies. AtRTD2 increases the diversity of transcripts and through application of stringent filters represents the most extensive and accurate transcript collection for Arabidopsis to date. We have demonstrated a generally good correlation of alternative splicing ratios from RNA-seq data analysed by Salmon and experimental data from high resolution RT-PCR. However, we have observed inaccurate quantification of transcript isoforms for genes with multiple transcripts which have variation in the lengths of their UTRs. This variation is not effectively corrected in RNA-seq analysis programmes and will therefore impact RNA-seq analyses generally. To address this, we have tested different genome-wide modifications of AtRTD2 to improve transcript quantification and alternative splicing analysis. As a result, we release AtRTD2-QUASI specifically for use in Quantification of Alternatively Spliced Isoforms and demonstrate that it out-performs other available transcriptomes for RNA-seq analysis. Conclusions We have generated a new transcriptome resource for RNA-seq analyses in Arabidopsis (AtRTD2) designed to address quantification of different isoforms and alternative splicing in gene expression studies. Experimental validation of alternative splicing changes identified inaccuracies in transcript quantification due to UTR length variation. To solve this problem, we also release a modified reference transcriptome, AtRTD2-QUASI for quantification of transcript isoforms, which shows high correlation with experimental data.

Background: Plants have adapted to tolerate and survive constantly changing environmental conditions by re-programming gene expression. The scale of the contribution of alternative splicing (AS) to stress responses has been underestimated due to limitations in RNA-seq analysis programs and poor representation of AS transcripts in plant databases. Significantly, the dynamics of the AS response have not been investigated but this is now possible with accurate transcript quantification programs and AtRTD2, a new, comprehensive transcriptome for Arabidopsis. Results: Using ultra-deep RNA-sequencing of a time-course of Arabidopsis thaliana plants exposed to cold treatment, we identified 8,949 genes with altered expression of which 2,442 showed significant differential alternative splicing (DAS) and 1,647 genes were regulated only at the level of AS (DAS-only). The high temporal resolution demonstrated the rapid induction of both transcription and AS resulting in coincident waves of differential expression (transcription) and differential alternative splicing in the first 6-9 hours of cold. The differentially expressed and DAS gene sets were largely non-overlapping, each comprising thousands of genes. The dynamic analysis of AS identified genes with rapid and sensitive AS within 3 h of transfer to the cold (early AS genes), which were enriched for splicing and transcription factors. A detailed investigation of the novel cold-response DAS-only gene, U2B2-LIKE, suggested that it regulates AS and is required for tolerance to freezing. Conclusions: Our data indicate that transcription and AS are the major regulators of transcriptome reprogramming that together govern the physiological and survival responses of plants to low temperature.

Summary Cold stress is one of the major environmental factors that limit growth and yield of plants. However, it is still not fully understood how plants account for daily temperature fluctuations, nor how these temperature changes are integrated with other regulatory systems such as the circadian clock. We demonstrate that REVEILLE2, a MYB-like transcription factor, exhibits a cold-induced alternative splicing switch from a non-translatable isoform at ambient temperature to a translatable isoform upon cold exposure. We explore the biological function of REVEILLE2 using a combination of molecular genetics, transcriptomics, and physiology. Disruption of the REVEILLE2 cooling switch alters regulatory gene expression, impairs circadian timing, and improves photosynthetic capacity. Changes in nuclear gene expression are particularly apparent in the initial hours following chilling, with chloroplast gene expression subsequently up-regulated. The REVEILLE2 cold switch extends our understanding of plants immediate response to cooling. We propose that the circadian component REVEILLE2 restricts plants responses to nocturnal reductions in temperature, thereby enabling appropriate responses to daily environmental changes. Plain language summary Plants need to respond appropriately to temperature, accounting for the expected daily patterns of reduced temperatures that occur every night relative to the day. Here, we show that a gene expressed at night fulfils this function.