CRISPR/Cas9 has revolutionized our ability to engineer genomes and conduct genome-wide screens in human cells1–3. Whereas some cell types are amenable to genome engineering, genomes of human pluripotent stem cells (hPSCs) have been difficult to engineer, with reduced efficiencies relative to tumour cell lines or mouse embryonic stem cells3–13. Here, using hPSC lines with stable integration of Cas9 or transient delivery of Cas9-ribonucleoproteins (RNPs), we achieved an average insertion or deletion (indel) efficiency greater than 80%. This high efficiency of indel generation revealed that double-strand breaks (DSBs) induced by Cas9 are toxic and kill most hPSCs. In previous studies, the toxicity of Cas9 in hPSCs was less apparent because of low transfection efficiency and subsequently low DSB induction3. The toxic response to DSBs was P53/TP53-dependent, such that the efficiency of precise genome engineering in hPSCs with a wild-type P53 gene was severely reduced. Our results indicate that Cas9 toxicity creates an obstacle to the high-throughput use of CRISPR/Cas9 for genome engineering and screening in hPSCs. Moreover, as hPSCs can acquire P53 mutations14, cell replacement therapies using CRISPR/Cas9-enginereed hPSCs should proceed with caution, and such engineered hPSCs should be monitored for P53 function. CRISPR–Cas9-induced DNA damage triggers p53 to limit the efficiency of gene editing in human pluripotent cells.

Ant Variation Ants of the same genotype can exhibit numerous phenotypic forms and develop multiple functional castes within a colony. Bonasio et al. (p. 1068 ) sequenced the genomes of two ant species exhibiting differences in caste development— Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator —and used the sequences to compare gene expression and identify differences in epigenetic gene regulation that lead to the phenotypic differences. Ants may offer a model system for studying the role of epigenetics in behavior and development.

Abstract Background & Aims Fibrolamellar carcinoma (FLC) is a rare, difficult-to-treat liver cancer primarily affecting pediatric and adolescent patients, and for which precision medicine approaches have historically not been possible. The DNAJB1-PRKACA gene fusion was identified as a driver of FLC pathogenesis. We aimed to assess whether FLC tumors maintain dependency on this gene fusion and determine if PRKACA is a viable therapeutic target. Methods FLC patient-derived xenograft (PDX) shRNA cell lines were implanted subcutaneously into female NOD-SCID mice and tumors were allowed to develop prior to randomization to doxycycline (to induce knockdown) or control groups. Tumor development was assessed every 2 days. To assess the effect of treatment with novel selective PRKACA small molecule kinase inhibitors, BLU0588 and BLU2864, FLC PDX tumor cells were implanted subcutaneously into NOD-SCID mice and tumors allowed to develop. Mice were randomized to treatment (BLU0588 and BLU2864, orally, once daily) or control groups and tumor size determined as above. Results Knockdown of DNAJB1-PRKACA reversed a FLC-specific gene signature and reduced PDX tumor growth in mice compared to the control group. Furthermore, FLC PDX tumor growth was significantly reduced with BLU0588 and BLU2864 treatment versus control ( P = 0.003 and P = 0.0005, respectively). Conclusions We demonstrated, using an inducible knockdown and small molecule approaches, that FLC PDX tumors were dependent upon DNAJB1 - PRKACA fusion activity. In addition, this study serves as a proof-of-concept that PRKACA is a viable therapeutic target for FLC and warrants further investigation.

Triggering receptor expressed in myeloid cells (TREM2) is a member of the immunoglobulin superfamily and is expressed in macrophages, dendritic cells, microglia, and osteoclasts. TREM2 plays a role in phagocytosis, regulates release of cytokine, contributes to microglia maintenance, and its ectodomain is shed from the cell surface. Using both pharmacological and genetic approaches we report here that the main protease contributing to the release of TREM2 ectodomain is ADAM17, (a disintegrin and metalloproteinase domain containing protein, also called TACE, TNFα converting enzyme) while ADAM10 plays a minor role. Using mutational analysis, we demonstrate that the main cleavage site of the sheddases is located within the stalk region of TREM2 proximal to the plasma membrane. Complementary biochemical experiments reveal that cleavage occurs between histidine 157 and serine 158. Shedding is not altered for the R47H-mutated TREM2 protein that confers an increased risk for the development of Alzheimers disease. O-glycosylation is detected within the stalk region, but distant to the cleavage site. These findings reveal a link between shedding of TREM2 and its regulation during inflammatory conditions or chronic neurodegenerative disease like AD in which activity or expression of sheddases might be altered.

Aim: Kidney impairment is observed in patients with COVID-19. We aimed to demonstrate the effect of anti-COVID-19 agent remdesivir on renal fibrosis. Methods: Remdesivir and its active nucleoside metabolite GS-441524 were used to treat TGF-beta stimulated renal fibroblasts (NRK-49F) and human renal epithelial cells (HK2). Cell viability was determined by CCK8 assay, and fibrotic markers were measured by Western blotting. Vehicle or remdesivir were given by intraperitoneal injection or renal injection through the left ureter in unilateral ureteral obstruction (UUO) mice. Serum and kidneys were harvested. The concentrations of remdesivir and GS-441524 were measured using LC-MS/MS. Renal and liver function were assessed. Renal fibrosis was evaluated by Massons trichrome staining and Western blotting. Results: Remdesivir and GS-441524 inhibited cell proliferation and the expression of fibrotic markers (fibronectin, pSmad3, and aSMA) in NRK-49F and HK2 cells. Intraperitoneal injection or renal injection of remdesivir attenuated renal fibrosis of UUO kidneys. Renal and liver function were not changed in remdesivir treated UUO mice. Remdesivir can not be detected, but two remdesivir metabolites were detected after injection. Conclusion: Remdesivir inhibits renal fibrosis in obstructed kidneys.

CRISPR/Cas9 has revolutionized our ability to engineer genomes and to conduct genome-wide screens in human cells. While some cell types are easily modified with Cas9, human pluripotent stem cells (hPSCs) poorly tolerate Cas9 and are difficult to engineer. Using a stable Cas9 cell line or transient delivery of ribonucleoproteins (RNPs) we achieved an average insertion or deletion efficiency greater than 80%. This high efficiency made it apparent that double strand breaks (DSBs) induced by Cas9 are toxic and kill most treated hPSCs. Cas9 toxicity creates an obstacle to the high-throughput use CRISPR/Cas9 for genome-engineering and screening in hPSCs. We demonstrated the toxic response is tp53-dependent and the toxic effect of tp53 severely reduces the efficiency of precise genome-engineering in hPSCs. Our results highlight that CRISPR-based therapies derived from hPSCs should proceed with caution. Following engineering, it is critical to monitor for tp53 function, especially in hPSCs which spontaneously acquire tp53 mutations.

Abstract Mutations in PKD1 (encoding polycystin-1) or PKD2 (encoding polycystin-2) gene cause autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), however high levels of polycystins are detected in renal tissues of ADPKD patients. Animal studies showed that loss and gain of function of polycystins are both pathogenic and can induce cystic phenotype in the kidney, which are associated with enhanced renal fibrosis. Recent studies showed that increased expression of polycystins contributes to organ fibrosis. However, the role of polycystins in renal tubulointerstitial fibrosis remains unclear. In this study, we demonstrated that polycystin-1 or polycystin-2 was highly expressed in the kidney of two different fibrotic mouse models and positively correlated with expression of collagen-I. Pharmaceutical inhibition of polycystin-2 with triptolide or genetic knockout of polycystin-2 reduced the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers and deposition of extracellular matrix proteins in fibrotic kidneys. Similarly, conditional knockout of Pkd1 gene also attenuated renal fibrosis in mouse models. Thus, we further hypothesized that inhibition of polycystins delays cyst growth by mitigating renal fibrosis. Here, we showed that polycystin-1 or polycystin-2 was up-regulated in Pkd2 or Pkd1 mice respectively and tightly correlated with the growth of renal cysts and fibrosis development. Genetic deletion of both polycystin-1 and polycystin-2 retarded cyst growth in Pkd1 or Pkd2 mice. Finally, we deleted pkd1 gene in a fibrosis triggered adult ADPKD mouse model at different time point before or after the fibrotic injury. We showed that early and long-term inactivation of Pkd1 delayed fibrosis triggered renal cyst growth in adult Pkd1 mice as compared with mice with late and short-term inactivation of Pkd1 gene. We conclude that tubular obstruction induced polycystin up-regulation is pro-fibrotic and accelerates cyst growth through enhancing renal interstitial fibrosis in ADPKD mice. Our study indicates that ADPKD is caused by both loss and gain function of polycystins. Reduction of the aberrant upregulation of polycystins in cystic kidneys is a therapeutic option for ADPKD patients. Research highlights Polycystin1 and polycystin-2 are up-regulated in fibrotic kidneys Inhibition or deletion of polycystins inhibits EMT and attenuates renal tubulointerstitial fibrosis Upregulation of polycystin1 or polycystin-2 is positively correlated with fibrosis progression and renal cyst growth in ADPKD mice Double knockout of Pkd1 and Pkd2 gene inhibits renal cyst growth in ADPKD mice Long-term deletion of Pkd1 gene delayed fibrosis triggered renal cyst growth in ADPKD mice

Abstract Renal fibrosis is the final pathological pathway of various kidney disease in progression to the end stage of renal failure. Recent studies showed that the histone methyltransferase enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is an important epigenetic regulator of renal fibrosis by promoting epithelial-mesenchymal transition (EMT) and activation of TGF-β/Smad3 signaling pathway in fibrotic kidneys. Triptolide is component extracted from radix tripterygium wilfordii, which provides renal benefits to patients with renal diseases in China. Recently, triptolide was identified as an inhibitor of EZH2. Thus, we hypothesized that triptolide inhibits renal fibrosis through EZH2. In this study, we found that triptolide reduced the deposition of extracellular matrix in the kidney of unilateral ureteral obstruction (UUO) mice. The anti-fibrotic effect of triptolide was further confirmed in TGF-β stimulated HK2 cells, a human renal epithelial cell line. Moreover, treatment of triptolide blocked the up-regulation of EZH2 in UUO kidneys and reduced the expression of EZH2 in TGF-β stimulated HK2 cells. Down-regulation of EZH2 by triptolide was correlated with reduced expression of EMT markers and phosphorylation of Smad3 in UUO kidneys and TGF-β stimulated HK2 cells. Finally, we showed that inhibition of EZH2 by 3-DZNep attenuated the inhibitory effect of triptolide on the expression of extracellular matrix protein, EMT markers and activation of Smad3 in TGF-β stimulated HK2 cells. In conclusion, triptolide inhibits renal tubulointerstitial fibrosis through EZH2 in obstructive kidneys.

Abstract Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a life-long disease and caused by mutations in PKD1 or PKD2 gene. Fibrosis is a hallmark of chronic kidney disease and is positively correlated with renal cyst growth, however the role of fibrosis in ADPKD is still controversial. In this study, we established renal fibrosis by toxic or surgical injuries in adult mice, and Pkd gene was inactivated at different time point before or after renal injury according to the pattern of fibrosis progression in different injury models. Here we showed that renal injury before or after Pkd gene inactivation can both induce renal cysts in adult Pkd1 or Pkd2 mice, and the extent of cystic burden was tightly correlated with the baseline levels of fibrosis when three hits (injury and gene inactivation) occurred. Inactivation of Pkd1 gene at the recovery stage after surgery induced less renal cysts in adult Pkd1 mice. Enhanced renal fibrosis by repeated toxic injuries before gene inactivation accelerated renal cyst growth in Pkd1 mice. We further showed that the rate of cyst formation at the early stage in adult Pkd1 mice was positively correlated with the baseline levels of renal fibrosis. Finally, we showed that conditional knockout of Ezh2 gene attenuated renal fibrosis and cyst growth in adult Pkd1 mice with pre-existing renal fibrosis. We conclude that the fibrotic response after renal injury is a driving force for renal cyst formation and growth in adult kidneys and inhibition of renal fibrosis through targeting EZH2 might be new therapeutic strategy for adult ADPKD. Importantly, our study suggests that there is a time window for intervention upon acute kidney injury in adult ADPKD patients. Translational Statement Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a life-long disease and caused by mutations in PKD1 or PKD2 gene. Fibrosis is a hallmark of chronic kidney disease and is positively correlated with renal cyst growth, however the role of renal fibrosis in ADPKD is controversial. In this study, we found that renal cysts were formed in adult Pkd1 or Pkd2 mice with established renal fibrosis induced by toxic or ischemia reperfusion injuries. Cyst formation or growth in adult ADPKD mice was tightly correlated with baseline levels of renal fibrosis after third hits. Enhanced renal fibrosis before Pkd1 gene deletion in adult mice accelerated cyst growth. Inhibition of renal fibrosis through targeting EZH2 delayed cyst growth in adult ADPKD mice. Thus, renal fibrosis is a trigger of cyst formation and growth in adult ADPKD mice, and therapeutically targeting EZH2 might be new strategy to treat adult patients with ADPKD. Our study suggests that there is a time window for intervention upon acute kidney injury in adult ADPKD patients.