Abstract Müller cells are the main macroglial cells of the retina exerting a wealth of functions to maintain retinal homoeostasis. Upon pathological changes in the retina, they become gliotic with both protective and detrimental consequences. Accumulating data also provide evidence for a pivotal role of Müller cells in the pathogenesis of diabetic retinopathy (DR). While microglial cells, the resident immune cells of the retina are considered as main players in inflammatory processes associated with DR, the implication of activated Müller cells in chronic retinal inflammation remains to be elucidated. In order to assess the signaling capacity of Müller cells and their role in retinal inflammation, we performed in-depth proteomic analysis of Müller cell proteomes and secretomes after stimulation with INFγ, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, VEGF, TGFβ1, TGFβ2 and TGFβ3. We used both, primary porcine Müller cells and the human Müller cell line MIO-M1 for our hypothesis generating approach. Our results point towards an intense signaling capacity of Müller cells, which reacted in a highly discriminating manner upon treatment with different cytokines. Stimulation of Müller cells resulted in a primarily pro-inflammatory phenotype with secretion of cytokines and components of the complement system. Furthermore, we observed evidence for mitochondrial dysfunction, implying oxidative stress after treatment with the various cytokines. Finally, both MIO-M1 cells and primary porcine Müller cells showed several characteristics of atypical antigen-presenting cells, as they are capable of inducing MHC class I and MHC class II with co-stimulatory molecules. In line with this, they express proteins associated with formation and maturation of phagosomes. Thus, our findings underline the importance of Müller cell signaling in the inflamed retina, indicating an active role in chronic retinal inflammation underlying the pathogenesis of diabetic retinopathy.

Retinal degeneration is associated with complement system activation, but retinal sources of complement are unknown. Here, we describe the human and murine complement transcriptomes of Müller cells, microglia/macrophages, vascular cells, neurons and retinal pigment epithelium (RPE) in health and disease. All cell populations expressed c1s, c3, cfb, cfp, cfh and cfi. Murine Müller cells contributed the highest amount of complement activators (c1s, c3, cfb). RPE mainly expressed cfh, while cfi and cfp transcripts were most abundant in neurons. The main complement negative regulator in the human retina was cfi, while cfh dominated in the murine retina. Importantly, the expression of c1s, cfb, cfp, cfi increased and that of cfh decreased with aging. Impaired photoreceptor recycling led to an enhanced c3 expression in RPE and to a reduced cfi expression in microglia/macrophages. Expression of complement components was massively upregulated after transient retinal ischemia in murine microglia, Müller cells and RPE. The individual signature of complement expression in distinct murine and human retinal cell types indicates a local, well-orchestrated regulation of the complement system in both species.

Oxidative stress can impair the endothelial barrier and thereby enable autoantibody migration in Neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD). Tissue-specific vulnerability to autoantibody-mediated damage could be explained by a differential, tissue-dependent endothelial susceptibility to oxidative stress. In this study, we aim to investigate the barrier integrity and complement profiles of brain and retinal endothelial cells under oxygen-induced oxidative stress to address the question of whether the pathomechanism of NMOSD preferentially affects the brain or the retina. Primary human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) and primary human retinal endothelial cells (HREC) were cultivated at different cell densities (2.5*104 to 2*105 cells/cm2) for real-time cell analysis. Both cell types were exposed to 100, 500 and 2500 μM H2O2. Immunostaining (CD31, VE-cadherin, ZO-1) and Western blot, as well as complement protein secretion using multiplex ELISA were performed. HBMEC and HREC cell growth phases were cell type-specific. While HBMEC cell growth could be categorized into an initial peak, proliferation phase, plateau phase, and barrier breakdown phase, HREC showed no proliferation phase, but entered the plateau phase immediately after an initial peak. The plateau phase was 7 h shorter in HREC. Both cell types displayed a short-term, dose-dependent adaptive response to H2O2. Remarkably, at 100 μM H2O2, the transcellular resistance of HBMEC exceeded that of untreated cells. 500 μM H2O2 exerted a more disruptive effect on the HBMEC transcellular resistance than on HREC. Both cell types secreted complement factors H (FH) and I (FI), with FH secretion remaining stable after 2 h, but FI secretion decreasing at higher H2O2 concentrations. The observed differences in resistance to oxidative stress between primary brain and retinal endothelial cells may have implications for further studies of NMOSD and other autoimmune diseases affecting the eye and brain. These findings may open novel perspectives for the understanding and treatment of such diseases.

Oxidative stress induced damage of the retinal pigment epithelium (RPE) together with chronic inflammation has been suggested as major contributors to retinal diseases. Here, we examine the effects of oxidative stress and endogenous complement components on the RPE and its proinflammatory and proangiogenic responses. The RPE cell line, ARPE-19, treated with H2O2 reduced cell-cell contacts, increased marker for epithelial mesenchymal transition but showed less cell death. Stressed ARPE-19 cells increased the expression of complement receptors CR3 and C5aR1. CR3 was co-localized with cell-derived complement protein C3, which was observed in its activated form in ARPE-19 cells. C3 as well as its regulators CFH and properdin accumulated in ARPE-19 cells after oxidative stress independent from external complement sources. This cell associated complement accumulation promoted nlrp3 and foxp3 expression and subsequent increased secretion of proinflammatory and proangiogenic factors. The complement-associated ARPE-19 reaction to oxidative stress, independent from external complement source, was increased by using the PARP inhibitor olaparib. Our results indicated that RPE cell-derived complement proteins and receptors are involved in RPE cell homeostasis following oxidative stress and should be considered as targets for treatment developments for retinal degeneration.