Search and capture in space and time How immunological T cells scan target cells for ligands is poorly understood. Cai et al. examined microvillar dynamics in living T cells in three dimensions and real time. The T cells palpated all spots on a surface within about 1 min through rapid movements of their microvilli. The time it took to scan the surface matched the movement rate of cells through tissues. These contacts took place in the absence of T cell receptor recognition and were stabilized independently of signaling or the cytoskeleton. Instead, stabilization depended on ligand affinity. The findings explain why many of the previously described components of the immunological synapse and T cell receptor signaling reside on three-dimensional microvillar-derived projections. Science , this issue p. eaal3118

T cell exhaustion is a major impediment to antitumor immunity. However, it remains elusive how other immune cells in the tumor microenvironment (TME) contribute to this dysfunctional state. Here, we show that the biology of tumor-associated macrophages (TAMs) and exhausted T cells (Tex) in the TME is extensively linked. We demonstrate that in vivo depletion of TAMs reduces exhaustion programs in tumor-infiltrating CD8+ T cells and reinvigorates their effector potential. Reciprocally, transcriptional and epigenetic profiling reveals that Tex express factors that actively recruit monocytes to the TME and shape their differentiation. Using lattice light sheet microscopy, we show that TAM and CD8+ T cells engage in unique, long-lasting, antigen-specific synaptic interactions that fail to activate T cells but prime them for exhaustion, which is then accelerated in hypoxic conditions. Spatially resolved sequencing supports a spatiotemporal self-enforcing positive feedback circuit that is aligned to protect rather than destroy a tumor.

ABSTRACT How local interactions of actin regulators yield large-scale organization of cell shape and movement is not well understood. For example, why does the WAVE complex build lamellipodia, the broad sheet-like protrusions that power cell migration, whereas the homologous actin regulator N-WASP forms spiky finger-like actin networks? N-WASP is known to oligomerize into focal condensates that generate an actin finger. In contrast, the WAVE complex exhibits the linear distribution needed to generate an actin sheet. This linear organization of the WAVE complex could either arise from interactions with the actin cytoskeleton or could represent an ability of the complex to self-organize into a linear template. Using super-resolution microscopy, we find that the WAVE complex forms higher-order linear oligomers that curve into 270 nanometer-wide ring structures in the absence of actin polymer. These rings localize to the necks of membrane invaginations, which display saddle point geometries with positive curvature in one axis and negative curvature in the orthogonal axis. To investigate the molecular mechanism of saddle curvature enrichment, we show that the WAVE complex and IRSp53, a membrane curvature-sensitive protein, collaborate to recognize saddle curvature that IRSp53 cannot sense alone. This saddle preference for the WAVE complex could explain emergent cell behaviors, such as expanding and self-straightening lamellipodia as well as the ability of endothelial cells to recognize and seal transcellular holes. Our work highlights how partnering protein interactions enable complex shape sensing and how feedback between cell shape and actin regulators yields self-organized cell morphogenesis.

Summary T cell exhaustion is a major impediment to anti-tumor immunity. However, it remains elusive how other immune cells in the tumor microenvironment (TME) contribute to this dysfunctional state. Here we show that the biology of tumor-associated macrophages (TAM) and exhausted T cells (T ex ) in the TME is extensively linked. We demonstrate that in vivo depletion of TAM reduces exhaustion programs in tumor-infiltrating CD8 + T cells and reinvigorates their effector potential. Reciprocally, transcriptional and epigenetic profiling reveals that T ex express factors that actively recruit monocytes to the TME and shape their differentiation. Using lattice light sheet microscopy, we show that TAM and CD8 + T cells engage in unique long-lasting antigen-specific synaptic interactions that fail to activate T cells, but prime them for exhaustion, which is then accelerated in hypoxic conditions. Spatially resolved sequencing supports a spatiotemporal self-enforcing positive feedback circuit that is aligned to protect rather than destroy a tumor. Graphical Abstract

Abstract During immune surveillance, CD8 T cells scan the surface of antigen presenting cells using dynamic microvillar palpation and movements as well as by having their receptors pre-concentrated into patches. Here, we use real-time lattice light sheet microscopy to demonstrate the independence of microvillar and membrane receptor patch scanning. While T cell receptor (TCR) patches can distribute to microvilli, they do so stochastically and not preferentially as for other receptors such as CD62L. The distinctness of TCR patch movement from microvillar movement extends to many other receptors that form patches that also scan independently of the TCR. An exception to this is the CD8 co-receptor which largely co-migrates in patches that overlap with or are closely adjacent to those containing TCRs. Microvilli that assemble into a synapse contain various arrays of the engaged patches, notably of TCRs and the inhibitory receptor PD-1, creating a pastiche of occupancies that vary from microvillar contact to contact. In summary, this work demonstrates that localization of receptor patches within the membrane and on microvillar projections is stochastic prior to antigen detection and that such stochastic variation may play into the generation of many individually-composed receptor patch compositions at a single synapse. Significance statement Motile T cell microvilli palpate surfaces to facilitate surface scanning in a pattern that is independent of the movement of pre-formed patches of transmembrane antigen-receptors across those microvilli; once T cell receptors engage, the microvilli act to scaffold multiple receptors within a microvillar close-contact.

In order to drive productive tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) function, myeloid populations must direct antigens to the lymph node, including to resident antigen-presenting cells (APCs) that have never touched the tumor. It has long been supposed that APCs trade antigens with one another, but the dominant cell biology underlying that remains unknown. We used in vitro and in vivo assays together with lattice light sheet and multiphoton imaging to show that myeloid cells carry tumor antigen-laden vesicles that they trade with one another as they reach distant sites. This accounts for the majority of antigen displayed to T cells and provides tumors with a mechanism to access APCs that differentially direct T cell activation away from memory phenotypes. This work defines efficient cell biology that drives the first steps of TIL generation and represents a new frontier for engineering tumoral immunity.

Abstract T cells typically recognize their ligands using a defined cell biology – the scanning of their membrane microvilli to palpate their environment – while that same membrane scaffolds T cell receptors (TCRs) that can signal upon ligand binding. Chimeric antigen receptors (CARs) present both a therapeutic promise as well as a tractable means to study the interplay between receptor affinity, microvillar dynamics and T cell function. CARs are often built using single-chain variable fragments (scFvs) with far greater affinity than that of natural TCRs. We used high resolution lattice lightsheet (LLS) and total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging to visualize microvillar scanning in the context of variations in CAR design. This demonstrated that conventional CARs hyper-stabilized microvillar contacts relative to TCRs. Reducing the affinity and/or avidity of binding brought synapse microvillar dynamics into natural ranges, normalized synapse resolution and improved downstream effector function. This work highlights the importance of understanding the underlying cell biology when designing receptors for optimal antigen engagement.