Abstract The evolution of the obligate human pathogen Neisseria gonorrhoeae has been shaped by selective pressures from diverse host niche environments 1,2 as well as antibiotics 3,4 . The varying prevalence of antibiotic resistance across N. gonorrhoeae lineages 5 suggests that underlying metabolic differences may influence the likelihood of acquisition of specific resistance mutations 6,7 . We hypothesized that the requirement for supplemental CO 2 , present in approximately half of isolates 8 , reflects one such example of metabolic variation. Here, using a genome-wide association study and experimental investigations, we show that CO 2 -dependence is attributable to a single substitution in a β-carbonic anhydrase, canB . CanB 19E is necessary and sufficient for growth in the absence of CO 2 , and the hypomorphic CanB 19G variant confers CO 2 -dependence. Furthermore, ciprofloxacin resistance is correlated with CanB 19G in clinical isolates, and the presence of CanB 19G increases the likelihood of acquisition of ciprofloxacin resistance. Together, our results suggest that metabolic variation has impacted the acquisition of fluoroquinolone resistance.

Summary Cholera was absent from Haiti until an inadvertent introduction by United Nations security forces in October 2010. The ensuing epidemic sickened 820,000 and caused 9,792 reported deaths 1 . The last cholera case in Haiti was recorded in January 2019, and in February 2022, Haiti was declared to have eliminated cholera 2 . In late September of 2022, a new outbreak began in Port-au-Prince and rapidly expanded to 964 suspected cases by mid-October of which 115 were confirmed by culture. 3 Here, we present genomic and phenotypic analysis of the Vibrio cholerae isolated from a stool sample collected on September 30th, 2022 of an index case – a 10-year-old girl who presented with watery diarrhea and severe dehydration – to address the origins of the epidemic.

Increasing Neisseria gonorrhoeae resistance to ceftriaxone, the last antibiotic recommended for empiric gonorrhea treatment, poses an urgent public health threat. However, the genetic basis of reduced susceptibility to ceftriaxone is not completely understood: while most ceftriaxone resistance in clinical isolates is caused by target site mutations in penA , others lack these mutations. Here, we show that penA -independent ceftriaxone resistance has evolved multiple times through distinct mutations in rpoB and rpoD . We identify five mutations in these genes that each increase resistance to ceftriaxone, including one mutation that arose independently in two lineages, and show that clinical isolates from multiple lineages are a single nucleotide change from ceftriaxone resistance. These RNA polymerase mutations result in large-scale transcriptional changes without altering susceptibility to other antibiotics, reducing growth rate, or deranging cell morphology. These results underscore the unexpected diversity of pathways to resistance and the importance of continued surveillance for novel resistance mutations.

Neisseria gonorrhoeae is an urgent public health threat due to rapidly increasing incidence and antibiotic resistance. In contrast with the trend of increasing resistance, clinical isolates that have reverted to susceptibility regularly appear, prompting questions about which pressures compete with antibiotics to shape gonococcal evolution. Here, we used genome-wide association on the largest collection of N. gonorrhoeae isolates to date (n=4882) to identify loss-of-function (LOF) mutations in the efflux pump mtrCDE operon as a mechanism of increased antibiotic susceptibility and demonstrate that these mutations are overrepresented in cervical isolates relative to urethral isolates (odds ratio (OR) = 3.74, 95% CI [1.98-6.70]). In support of a model in which pump expression incurs a fitness cost in this niche, cervical isolates were also enriched relative to urethral isolates in LOF mutations in the mtrCDE activator mtrA (OR = 8.60, 95% CI [4.96-14.57]) and in farA , a subunit of the FarAB efflux pump (OR = 6.25, 95% CI [3.90-9.83]). In total, approximately 1 in 3 cervical isolates (36.4%) contained a LOF mutation in either the efflux pump components mtrC or farA or the activator mtrA . Our findings extend beyond N. gonorrhoeae to other Neisseria : mtrC LOF mutations are rare (<1%) in the primarily nasopharyngeal-colonizing N. meningitidis in a collection of 14,798 genomes but enriched in a heterosexual urethritis-associated lineage (8.6%, p = 9.90x10-5), indicating that efflux pump downregulation contributes broadly to the adaptation of pathogenic Neisseria to the female urogenital tract. Overall, our findings highlight the impact of integrating microbial population genomics with host metadata and demonstrate how host environmental pressures can lead to increased antibiotic susceptibility.

Abstract The etiologic agent of gonorrhea, Neisseria gonorrhoeae , has become resistant to each of the first line antibiotics used to treat it. However, most isolates in the US remain susceptible to ciprofloxacin, leading to the hypothesis that a diagnostic that accurately reports susceptibility to ciprofloxacin may allow its reintroduction into clinical use. One diagnostic approach is to identify codon 91 in gyrA , where coding for the wildtype serine is associated with ciprofloxacin susceptibility and phenylalanine with resistance. Here, we found that escape from this diagnostic method can occur through gyrA F91S reversion and expansion of pre-existing ciprofloxacin non-susceptible N. gonorrhoeae lineages with gyrA 91S. Furthermore, we found that mutations conferring ciprofloxacin resistance in gyrA 91S isolates led to cross-resistance with zoliflodacin, an antibiotic in phase 3 trial for treatment of gonorrhea. These findings define N. gonorrhoeae mutations that should be monitored via surveillance systems, particularly in populations and regions deploying gyrA 91-based diagnostics, and demonstrate how diagnostics that guide antibiotic therapy can have unintended consequences.

Abstract Human challenge studies are instrumental for testing cholera vaccines, but these studies use outdated strains and require inpatient facilities. Here, we created next-generation isogenic Ogawa and Inaba V. cholerae challenge strains (ZChol strains) derived from a contemporary Zambian clinical isolate representative of current dominant pandemic V. cholerae . To minimize the risk of severe diarrhea these strains were rendered non-toxigenic, since antibody responses which limit V. cholerae colonization are the primary mechanism of immune protection. These strains did not cause diarrhea in infant mice and proved to accurately gauge reduction in intestinal colonization mediated by effective vaccination. They are also valuable as targets for measuring vibriocidal antibody responses. Using barcoded ZChol strains, we discovered that vaccination tightens the infection bottleneck without restricting pathogen expansion in vivo . ZChol strains have the potential to enhance the safety, relevance, and scope of future cholera vaccine challenge studies and be valuable reagents for studies of immunity to cholera.