Abstract Recently it has been demonstrated that single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM) at 200 keV is capable of determining protein structures, including those smaller than 100 kDa, at sub-3.0 Å resolutions, without using significant defocus or a phase plate. However, the majority of near-atomic resolution cryo-EM structures has been determined using 300 keV. Consequently, many typical parameter settings for the cryo-EM computational image processing steps, especially those associated with the contrast transfer function, are based on the accumulated experience of 300 kV cryo-EM. We have therefore revised these parameters, established theoretical bases for criteria to find an optimal mask diameter and box size for a given dataset irrespective of acceleration voltage or protein size, and proposed a protocol. Considering the defocus distributions of the datasets, merely optimizing the mask diameters and box sizes yielded meaningful resolution improvements for the reconstruction of < 200 kDa proteins using 200 kV cryo-EM.

Abstract Cu-containing nitrite reductases (NiRs), a well-studied family of 110 kDa enzymes, play central roles in denitrification and have over 100 Protein Data Bank entries. However, such issues as crystal packing, photoreduction, and lack of high pH cases have impeded structural analysis of the catalytic mechanism. Here we show the cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structures of Achromobacter cycloclastes NiR ( Ac NiR) at 2.99 and 2.85 Å resolution with pH 6.2 and 8.1, respectively. Comprehensive comparisons with cryo-EM and 56 Ac NiR crystal structures suggested crystallographic artifacts in residues 185–215 and His255 due to packing and photoreduction, respectively. With electron paramagnetic resonance spectroscopy, a newly developed map comparison method supported local structural changes at pH 8.1 around the type-2 Cu site, including His255 deprotonation. While the theoretical coordination error estimation of cryo-EM structures remains difficult, combined analysis using X-ray and cryo-EM structures will allow deeper insight into the local structural changes of proteins.

KAMO and Blend provide particularly effective tools to automatically manage the merging of large numbers of data sets from serial crystallography. The requirement for manual intervention in the process can be reduced by extending Blend to support additional clustering options to increase the sensitivity to differences in unit cell parameters and to allow for clustering of nearly complete datasets on the basis of intensity or amplitude differences. If datasets are already sufficiently complete to permit it, apply KAMO once, just for reflections. If starting from incomplete datasets, one applies KAMO twice, first using cell parameters. In this step either the simple cell vector distance of the original Blend is used, or the more sensitive NCDist, to find clusters to merge to achieve sufficient completeness to allow intensities or amplitudes to be compared. One then uses KAMO again using the correlation between the reflections at the common HKLs to merge clusters in a way sensitive to structural differences that may not perturb the cell parameters sufficiently to make meaningful clusters. Many groups have developed effective clustering algorithms that use a measurable physical parameter from each diffraction still or wedge to cluster the data into categories which can then be merged to, hopefully, yield the electron density from a single protein iso-form. What is striking about many of these physical parameters is that they are largely independent from one another. Consequently, it should be possible to greatly improve the efficacy of data clustering software by using a multi-stage partitioning strategy. Here, we have demonstrated one possible approach to multi-stage data clustering. Our strategy was to use unit-cell clustering until merged data was of sufficient completeness to then use intensity based clustering. We have demonstrated that, using this strategy, we were able to accurately cluster data sets from crystals that had subtle differences.

The Kinesin-5 motor Cut7 in Schizosaccharomyces pombe plays essential roles in spindle pole separation, leading to the assembly of bipolar spindle. In many organisms, simultaneous inactivation of Kinesin-14s neutralizes Kinesin-5 deficiency. To uncover the molecular network that counteracts Kinesin-5, we have conducted a genetic screening for suppressors that rescue the cut7-22 temperature sensitive mutation, and identified 10 loci. Next generation sequencing analysis reveals that causative mutations are mapped in genes encoding α-, β-tubulins and the microtubule plus-end tracking protein Mal3/EB1, in addition to the components of the Pkl1/Kinesin-14 complex. Moreover, the deletion of various genes required for microtubule nucleation/polymerization also suppresses the cut7 mutant. Intriguingly, Klp2/Kinesin-14 levels on the spindles are significantly increased in cut7 mutants, whereas these increases are negated by suppressors, which may explain the suppression by these mutations/deletions. Consistent with this notion, mild overproduction of Klp2 confers temperature sensitivity. Surprisingly, treatment with a microtubule-destabilizing drug not only suppresses cut7 temperature sensitivity but also rescues the lethality resulting from the deletion of cut7, though a single klp2 deletion per se cannot compensate for the loss of Cut7. We propose that microtubule assembly and/or dynamics antagonize Cut7 functions, and that the orchestration between these two factors is crucial for bipolar spindle assembly.

Kinesin motors play central roles in bipolar spindle assembly. In many eukaryotes, spindle pole separation is driven by Kinesin-5 that generates outward force. This outward force is balanced by antagonistic inward force elicited by Kinesin-14 and/or Dynein. In fission yeast, two Kinesin-14s, Pkl1 and Klp2, play an opposing role against Kinesin-5/Cut7. However, how these two Kinesin-14s coordinate individual activities remains elusive. Here we show that while deletion of either pkl1 or klp2 rescues temperature sensitive cut7 mutants, only pkl1 deletion can bypass the lethality caused by cut7 deletion. Pkl1 is tethered to the spindle pole body, while Klp2 is localized along the spindle microtubule. Forced targeting of Klp2 to the spindle pole body, however, compensates for Pkl1 functions, indicating that cellular localizations, rather than individual motor specificities, differentiate between the two Kinesin-14s. Interestingly, human Kinesin-14/HSET can replace either Pkl1 or Klp2. Moreover, overproducing HSET induces monopolar spindles, reminiscent of the phenotype of Cut7 inactivation. Taken together, this study has uncovered the biological mechanism of how two different Kinesin-14s exert their antagonistic roles against Kinesin-5 in a spatially distinct manner.