Time-lapse imaging of bacteria growing in micro-channels in a controlled environment has been instrumental in studying the single cell dynamics of bacterial growth. This kind of a microfluidic setup with growth chambers is popularly known as mother machine [1]. In a typical experiment with such a set-up, bacterial growth can be studied for numerous generations with high resolution and temporal precision using image processing. However, as in any other experiment involving imaging, the image data from a typical mother machine experiment has considerable intensity fluctuations, cell intrusion, cell overlapping, filamentation etc. The large amount of data produced in such experiments makes it hard for manual analysis and correction of such unwanted aberrations. We have developed a modular code for segmentation and analysis of mother machine data (SAM) for rod shaped bacteria where we can detect such aberrations and correctly treat them without manual supervision. We track cumulative cell size and use an adaptive segmentation method to avoid faulty detection of cell division. SAM is currently written and compiled using MATLAB. It is fast (∼ 15 min/GB of image) and can be efficiently coupled with shell scripting to process large amount of data with systematic creation of output file structures and graphical results. It has been tested for many different experimental data and is publicly available in Github.

Biological evolution of a population is governed by the fitness landscape, which is a map from genotype to fitness. However, a fitness landscape depends on the organisms environment, and evolution in changing environments is still poorly understood. We study a particular model of antibiotic resistance evolution in bacteria where the antibiotic concentration is an environmental parameter and the fitness landscapes incorporate tradeoffs between adaptation to low and high antibiotic concentration. With evolutionary dynamics that follow fitness gradients, the evolution of the system under slowly changing antibiotic concentration resembles the athermal dynamics of disordered physical systems under quasistatic external drives. Specifically, our model can be described as a system with interacting hysteretic elements, and it exhibits effects such as hysteresis loops and memory formation under antibiotic concentration cycling. Using methods familiar from studies in this field, we derive a number of analytical and numerical results. Our approach provides a general framework for studying motifs of evolutionary dynamics in biological systems in a changing environment.

Abstract For a better understanding of the evolution of antibiotic resistance, it is imperative to study the factors that determine the initial establishment of mutant resistance alleles. In addition to the antibiotic concentration, the establishment of resistance alleles may be affected by interactions with the surrounding susceptible cells from which they derive, for instance via the release of nutrients or removal of the antibiotic. Here, we investigate the effects of social interactions with surrounding susceptible cells on the establishment of Escherichia coli mutants with increasing β-lactamase activity (i.e. the capacity to hydrolyze β-lactam antibiotics) from single cells under the exposure of the antibiotic cefotaxime on agar plates. We find that mutant establishment probability is increased in the presence of susceptible cells due to the active breakdown of the antibiotic, but the rate of breakdown by the susceptible strain is much higher than expected based on its low enzymatic activity. A detailed theoretical model suggests that this observation can be explained by cell filamentation causing delayed lysis. While susceptible cells may hamper the spread of higher-resistant β-lactamase mutants at relatively high frequencies, our findings show that they could promote establishment during their emergence.

Abstract For antibiotic resistance to arise, new resistant mutants must establish in a bacterial population before they can spread via natural selection. Comprehending the stochastic factors that influence mutant establishment is crucial for a quantitative understanding of antibiotic resistance emergence. Here, we quantify the single-cell establishment probability of four Escherichia coli strains expressing β-lactamase alleles with different activity against the antibiotic cefotaxime, as a function of antibiotic concentration in both unstructured (liquid) and structured (agar) environments. We show that concentrations well below the minimum inhibitory concentration (MIC) can substantially hamper establishment, particularly for highly resistant mutants. While the pattern of establishment suppression is comparable in both tested environments, we find greater variability in establishment probability on agar. Using a simple branching model, we investigate possible sources of this stochasticity, including environment-dependent lineage variability. Lastly, we use the single-cell establishment probability to predict each strain’s MIC in the absence of social interactions. We observe substantially higher measured than predicted MIC values, particularly for highly resistant strains, which indicates cooperative effects among resistant cells at large cell numbers, such as in standard MIC assays.

The extent of parallel evolution at the genotypic level is quantitatively linked to the distribution of beneficial fitness effects (DBFE) of mutations. The standard view, based on light-tailed distributions (i.e. distributions with finite moments), is that the probability of parallel evolution in duplicate populations is inversely proportional to the number of available mutations, and moreover that the DBFE is sufficient to determine the probability when the number of available mutations is large. Here we show that when the DBFE is heavy-tailed, as found in several recent experiments, these expectations are defied. The probability of parallel evolution decays anomalously slowly in the number of mutations or even becomes independent of it, implying higher repeatability of evolution. At the same time, the probability of parallel evolution is non-self-averaging , that is, it does not converge to its mean value even when a large number of mutations are involved. This behavior arises because the evolutionary process is dominated by only a few mutations of high weight. Consequently, the probability varies widely across systems with the same DBFE. Contrary to the standard view, the DBFE is no longer sufficient to determine the extent of parallel evolution, making it much less predictable. We illustrate these ideas theoretically and through analysis of empirical data on antibiotic resistance evolution.

It is well known that microbial cell populations can exhibit sustained exponential growth. More surprising is the fact that at high antibiotic levels, cell populations exhibit sustained exponential decay over several orders of magnitude. The boundary between growth and decay occurs at the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of the antibiotic, where the density of living cells remains constant over time. These observations suggest that positive (growth) or negative (decay) exponents arise as a difference of cell division and death rates obeying first-order kinetics. Thus for antibiotic concentrations below MIC, division dominates; for concentrations above MIC, death dominates; while MIC itself is a dynamic steady state of balanced division and death, rather than cell stasis. To measure these rates we separately tracked living and dead cells in Escherichia coli populations treated with the ribosome-targeting antibiotic kanamycin. We found that cells divide rapidly even at MIC: inferred division and death rates at MIC are 0.6 times the antibiotic-free division rate. A stochastic model of cells as collections of self-replicating units we term “widgets” reproduces both steady-state and transient features of our experiments, and explains first-order exponential kinetics. In this model cell division and death rates at MIC can be tuned from low to high values by amplifying molecular noise in the synthesis, degradation and partitioning of the widgets. At extremely low noise, cells approach the classic bacteriostatic limit at MIC: neither dividing nor dying. Noise-induced division and death of cells following antibiotic treatment could increase the likelihood of sepsis and antibiotic resistance.

Fitness effects of mutations depend on environmental parameters. For example, mutations that increase fitness of bacteria at high antibiotic concentration often decrease fitness in the absence of antibiotic, exemplifying a tradeoff between adaptation to environmental extremes. We develop a mathematical model for fitness landscapes generated by such tradeoffs, based on experiments that determine the antibiotic dose-response curves of Escherichia coli strains, and previous observations on antibiotic resistance mutations. Our model generates a succession of landscapes with predictable properties as antibiotic concentration is varied. % The number of fitness optima and number of mutations in them depend % in a simple manner on the antibiotic concentration. The landscape is nearly smooth at low and high concentrations, but the tradeoff induces a high ruggedness at intermediate antibiotic concentrations. Despite this high ruggedness, however, all the fitness maxima in the landscapes are evolutionarily accessible from the wild type. This implies that selection for antibiotic resistance in multiple mutational steps is relatively facile despite the complexity of the underlying landscape.

Birth-death models have long been employed to understand the interplay of genetic drift and natural selection. While well-mixed populations remain unaffected by the choice of replacement rules, the evolutionary outcomes in spatially structured populations are strongly impacted by this choice. Moving parent individuals to vacant sites gives rise to new update rules, leading to new fixation categories for spatial graphs. We discover a new category of graphs, amplifiers of fixation, where a structure has a higher probability of fixation for mutants than the well-mixed population, regardless of their fitness value. Under death-Birth updating with parents moving to vacant sites, the star graph is an amplifier of fixation. For very large population sizes, the probability to fix deleterious mutants on the star graph converges to a non-zero value, in contrast to the result from well-mixed populations where the probability goes to zero. Additionally, most random graphs are amplifiers of fixation for death-Birth updating, with parent individuals replacing dead individuals. Conversely, most random graphs are suppressors of fixation$-$ graphs with lower fixation probability for mutants regardless of their fitnesses$-$ for Birth-death updating with offspring replacing dead individuals. When subjected to long-term evolution, amplifiers of fixation, despite being more efficient at fixing beneficial mutants, attain lower fitness than the well-mixed population, whereas suppressors attain higher fitness despite their inferior ability to fix beneficial mutants. These surprising findings can be explained by their deleterious mutant regime. Therefore, the deleterious mutant regime can be as crucial as the beneficial mutant regime for adaptive evolution.