Abstract CTL and NK cells recognize and eliminate cancer cells. However, immune evasion, down regulation of immune function by the tumor microenvironment, or resistance of cancer cells are a major problem. While CTL and NK cells are both important to eliminate cancer, most studies address them individually. In a new experimental human model, we analysed combined primary human CTL and NK cell cytotoxicity against the melanoma cell line SK-Mel-5. At high effector-to-target ratios, MART-1-specific CTL or NK cells eliminated SK-Mel-5 cells within 24 hours indicating that SK-Mel-5 cells are initially not resistant. However, at lower effector-to-target ratios, which resemble conditions of the immune contexture in human cancer, a significant number of SK-Mel-5 cells survived. Whereas CTL pre-exposure induced resistance in surviving SK-Mel-5 cells to subsequent CTL or NK cell cytotoxicity, NK cell pre-exposure induced resistance in surviving SK-Mel-5 cells to NK cells but not to MART-1 specific CTL. In contrast, there was even a slight enhancement of CTL cytotoxicity against SK-Mel-5 cells following NK cell pre-exposure. In all other combinations, resistance to subsequent cytotoxicity was higher, if melanoma cells were pre-exposed to larger numbers of CTL or NK cells. Increases in human leukocyte antigen class I expression correlated with resistance to NK cells, while reduction in MART-1 antigen expression correlated with reduced CTL cytotoxicity. CTL cytotoxicity was rescued beyond control levels by exogenous MART-1 antigen. This study quantifies the interdependence of CTL and NK cell cytotoxicity and may guide strategies for efficient CTL-NK cell anti-melanoma therapies. Key points summary Cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells eliminate cancer cells. CTL and NK work in parallel, but most studies address them individually. In a new human experimental model, antigen-specific CTL and NK cell cytotoxicity interdependence against melanoma is shown. Whereas high numbers of antigen-specific CTL and NK cells eliminate all melanoma cells, lower, more physiological numbers induce resistance, in case secondary CTL or NK cell exposure follow initial CTL cell exposure or if secondary NK cell exposure follows initial NK cell exposure; only if secondary CTL exposure follows initial NK cell exposure no resistance of melanoma but even a slight enhancement of cytotoxicity was observed. Alterations in HLA-I expression correlated with resistance to NK cells, while reduction in antigen expression correlated with reduced CTL cytotoxicity. CTL cytotoxicity was rescued beyond control levels by exogenous antigen. The results should help to better understand and optimize immune therapies against cancer. Graphical abstract

Abstract Immunological memory is an important concept to protect humans against recurring diseases. Memory CD8 + T cells are required for quick expansion into effector cells but also provide immediate cytotoxicity against their targets. Whereas many functions of the two main cytotoxic subtypes, effector memory CD8 + T cells (T EM ) and central memory CD8 + T cells (T CM ), are relatively well defined, single T EM and T CM cell cytotoxicity has not been quantified. Here, we analyze human CD8 + subtype distribution following SEA stimulation and quantify the expression of death mediators, including perforin, granzyme B, FasL and TRAIL. We find higher perforin, granzyme B and FasL expression in T EM and compared to T CM . To quantify single T EM and T CM cytotoxicity, we develop a FRET-based fluorescent assay with NALM6 target cells stably transfected with a GFP-RFP FRET construct based on a caspase-cleavage sequence (apoptosis sensor Casper-GR). Applying this assay, T EM or T CM induced target cell apoptosis or necrosis can be quantified. We find that single T EM are much more effective than T CM in killing their targets mainly by apoptosis and secondary necrosis. The reason for this is the higher perforin expression and on a more efficient lytic immunological synapse during T EM -target contact compared to T CM -target contact. Defining and quantifying single T EM and T CM cytotoxicity and the respective mechanism should be helpful to optimize future subset-based immune therapies.

Abstract Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are involved in development of diabetes. However, the impact of excessive glucose on CTL-mediated antigen-independent killing remains elusive. Here, we report that TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) is substantially up- regulated in CTLs in environments with high glucose (HG) both in vitro and in vivo . The PI3K- Akt-NFκB axis and non-mitochondrial reactive oxygen species are essential in HG-induced TRAIL upregulation in CTLs. TRAIL high CTLs induce apoptosis of pancreatic beta cell line 1.4E7. Metformin and Vitamin D synergistically reduce HG-enhanced expression of TRAIL in CTLs and coherently protect 1.4E7 cells from TRAIL-mediated apoptosis. Notably, in patients with diabetes, correlation between Vitamin D concentrations in plasma and glucose levels is linked to HG-enhanced TRAIL expression on CTLs. Microarray data reveal that OXCT2, an important enzyme in ketone body catabolism, is a promising target in response to vitamin D. Our work not only reveals a novel mechanism of CTL involvement in progression of diabetes, but also establishes CTLs as a target for combined metformin and vitamin D therapy to protect pancreatic beta cells of diabetic patients.