Cerebrospinal fluid (CSF) flowing through periarterial spaces is integral to the brain's mechanism for clearing metabolic waste products. Experiments that track tracer particles injected into the cisterna magna (CM) of mouse brains have shown evidence of pulsatile CSF flow in perivascular spaces surrounding pial arteries, with a bulk flow in the same direction as blood flow. However, the driving mechanism remains elusive. Several studies have suggested that the bulk flow might be an artifact, driven by the injection itself. Here, we address this hypothesis with new in vivo experiments where tracer particles are injected into the CM using a dual-syringe system, with simultaneous injection and withdrawal of equal amounts of fluid. This method produces no net increase in CSF volume and no significant increase in intracranial pressure. Yet, particle-tracking reveals flows that are consistent in all respects with the flows observed in earlier experiments with single-syringe injection.

Cerebrospinal fluid (CSF) flows through the perivascular spaces surrounding cerebral arteries. Revealing the mechanisms driving its flow would bring improved understanding of brain waste transport and insights for disorders including Alzheimer’s disease, stroke, and traumatic brain injury. In vivo CSF velocity measurements in mice have been used to argue that flow is driven primarily by the pulsatile motion of artery walls — perivascular pumping. However, fluid dynamics theory and simulation have predicted that perivascular pumping produces flows differing from in vivo observations starkly, particularly in the phase and relative amplitude of flow oscillation. Here we show that coupling theoretical and simulated flows to realistic end boundary conditions, using resistance and compliance values measured in mice, results in velocities that match observations closely in phase, relative amplitude of oscillation, and mean flow speed. This new, quantitative agreement among theory, simulation, and in vivo measurement further supports the idea that perivascular pumping is a primary CSF driver in physiological conditions. Significance Statement The brain is immersed in cerebrospinal fluid, whose flow has long been thought to remove metabolic wastes and transport neurotransmitters, in addition to offering a potential path for drug delivery. Fluid has been hypothesized to enter the deep brain along spaces that surround arteries, but the mechanisms driving flow there have been debated. Experiments suggest artery wall pulsation drives the fluid in healthy conditions, but theories and simulations have predicted that wall-driven flows would have stronger oscillations and different phase than what is observed. We show that coupling those predictions to a simple but realistic model of the rest of the fluid pathway reconciles the differences, so that theory, simulation, and experiment agree.

ABSTRACT Cerebrospinal fluid (CSF) flows through the perivascular spaces (PVSs) surrounding cerebral arteries. Revealing the mechanisms driving that flow could bring improved understanding of brain waste transport and insights for disorders including Alzheimer’s disease and stroke. In vivo velocity measurements of CSF in surface PVSs in mice have been used to argue that flow is driven primarily by the pulsatile motion of artery walls — perivascular pumping. However, fluid dynamics theory and simulation have predicted that perivascular pumping produces flows differing from in vivo observations starkly, particularly in the phase and relative amplitude of flow oscillation. Here we show that coupling theoretical and simulated flows to realistic end boundary conditions, using resistance and compliance values measured in mice, results in velocities that match observations closely in phase, relative amplitude of oscillation, and mean flow speed. This new, quantitative agreement among theory, simulation, and in vivo measurement further supports the idea that perivascular pumping is a primary CSF driver in physiological conditions.

Abstract Cerebrospinal fluid (CSF) flowing through periarterial spaces is integral to the brain’s mechanism for clearing metabolic waste products. Experiments that track tracer particles injected into the cisterna magna of mouse brains have shown evidence of pulsatile CSF flow in pial periarterial spaces, with a bulk flow in the same direction as blood flow. However, the driving mechanism remains elusive. Several studies have suggested that the bulk flow might be an artifact, driven by the injection itself. Here, we address this hypothesis with new in vivo experiments where tracer particles are injected into the cisterna magna using a dual-syringe system, with simultaneous injection and withdrawal of equal amounts of fluid. This method produces no net increase in CSF volume and no significant increase in intracranial pressure. Yet, particle-tracking reveals flows in the pial periarterial spaces that are completely consistent with the flows observed in earlier experiments with single-syringe injection.

Cervical lymphatic vessels (cLVs) have been shown to drain solutes and cerebrospinal fluid (CSF) from the brain. However, their hydrodynamical properties have never been evaluated in vivo. Here, we developed two-photon optical imaging with particle tracking in vivo of CSF tracers (2P-OPTIC) in superficial and deep cLVs of mice, characterizing their flow and showing that the major driver is intrinsic pumping by contraction of the lymphatic vessel wall. Moreover, contraction frequency and flow velocity were reduced in aged mice, which coincided with a reduction in smooth muscle actin expression. Slowed flow in aged mice was rescued using topical application of prostaglandin F2α, a prostanoid that increases smooth muscle contractility, which restored lymphatic function in aged mice and enhanced central nervous system clearance. We show that cLVs are important regulators of CSF drainage and that restoring their function is an effective therapy for improving clearance in aging. Cervical lymphatics drain cerebrospinal fluid and clear metabolic waste from the brain. Du et al. show using 2P-OPTIC that these are disrupted in aging due to reduced pumping. Restoring cervical lymphatic function with prostaglandin F2α rescues brain clearance.

Microglia are the resident immune cells in the brain with the capacity to autonomously self-renew. Under basal conditions, microglial self-renewal appears to be slow and stochastic, although microglia have the ability to proliferate very rapidly following depletion or in response to injury. Because microglial self-renewal has largely been studied using static tools, the mechanisms and kinetics by which microglia renew and acquire mature characteristics in the adult brain are not well understood. Using chronic in vivo two-photon imaging in awake mice and PLX5622 (Colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R) inhibitor) to deplete microglia, we set out to understand the dynamic self-organization and maturation of microglia following depletion in the visual cortex. We confirm that under basal conditions, cortical microglia show limited turnover and migration. Following depletion, however, microglial repopulation is remarkably rapid and is sustained by the dynamic division of the remaining microglia in a manner that is largely independent of signaling through the P2Y12 receptor. Mathematical modeling of microglial division demonstrates that the observed division rates can account for the rapid repopulation observed in vivo . Additionally, newly-born microglia resemble mature microglia, in terms of their morphology, dynamics and ability to respond to injury, within days of repopulation. Our work suggests that microglia rapidly self-renew locally, without the involvement of a special progenitor cell, and that newly born microglia do not recapitulate a slow developmental maturation but instead quickly take on mature roles in the nervous system.Graphical Abstract (a) Microglial dynamics during control condition. Cartoon depiction of the heterogenous microglia in the visual cortex equally spaced. (b) During the early stages of repopulation, microglia are irregularly spaced and sparse. (c) During the later stages of repopulation, the number of microglia and the spatial distribution return to baseline. (d-f) We then created and ran a mathematical model that sampled the number of microglia, (d) the persistent doublets, (e) the rapid divisions of microglia and (f) the secondary divisions of microglia during the peak of repopulation day 2-day 3. The mathematical model suggested that residual microglia can account for the rapid repopulation we observed in vivo. ![Figure][1] [1]: pending:yes

Cerebrospinal fluid (CSF) flow is crucial for clearing metabolic waste from the brain, a process whose dysregulation is linked to neurodegenerative diseases like Alzheimer's. Traditional approaches like particle tracking velocimetry (PTV) are limited by their reliance on single-plane two-dimensional measurements, which fail to capture the complex dynamics of CSF flow fully. To overcome these limitations, we employ Artificial Intelligence Velocimetry (AIV) to reconstruct three-dimensional velocities, infer pressure and wall shear stress, and quantify flow rates. Given the experimental nature of the data and inherent variability in biological systems, robust uncertainty quantification (UQ) is essential. Towards this end, we have modified the baseline AIV architecture to address aleatoric uncertainty caused by noisy experimental data, enhancing our measurement refinement capabilities. We also implement UQ for the model and epistemic uncertainties arising from the governing equations and network representation. Toward this end, we test multiple governing laws, representation models, and initializations. Our approach not only advances the accuracy of CSF flow quantification but also can be adapted to other applications that use physics-informed machine learning to reconstruct fields from experimental data, providing a versatile tool for inverse problems.

Abstract Traditionally, the meninges are described as 3 distinct layers, dura, arachnoid and pia. Yet, the classification of the connective meningeal membranes surrounding the brain is based on postmortem macroscopic examination. Ultrastructural and single cell transcriptome analyses have documented that the 3 meningeal layers can be subdivided into several distinct layers based on cellular characteristics. We here re-examined the existence of a 4 th meningeal membrane, S ubarachnoid Ly mphatic-like M embrane or SLYM in Prox1-eGFP reporter mice. Imaging of freshly resected whole brains showed that SLYM covers the entire brain and brain stem and forms a roof shielding the subarachnoid cerebrospinal fluid (CSF)-filled cisterns and the pia-adjacent vasculature. Thus, SLYM is strategically positioned to facilitate periarterial influx of freshly produced CSF and thereby support unidirectional glymphatic CSF transport. Histological analysis showed that, in spinal cord and parts of dorsal cortex, SLYM fused with the arachnoid barrier layer, while in the basal brain stem typically formed a 1-3 cell layered membrane subdividing the subarachnoid space into two compartments. However, great care should be taken when interpreting the organization of the delicate leptomeningeal membranes in tissue sections. We show that hyperosmotic fixatives dehydrate the tissue with the risk of shrinkage and dislocation of these fragile membranes in postmortem preparations.