A protocol for differentiating mouse and human pluripotent stem cells into muscle. During embryonic development, skeletal muscles arise from somites, which derive from the presomitic mesoderm (PSM). Using PSM development as a guide, we establish conditions for the differentiation of monolayer cultures of mouse embryonic stem (ES) cells into PSM-like cells without the introduction of transgenes or cell sorting. We show that primary and secondary skeletal myogenesis can be recapitulated in vitro from the PSM-like cells, providing an efficient, serum-free protocol for the generation of striated, contractile fibers from mouse and human pluripotent cells. The mouse ES cells also differentiate into Pax7+ cells with satellite cell characteristics, including the ability to form dystrophin+ fibers when grafted into muscles of dystrophin-deficient mdx mice, a model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Fibers derived from ES cells of mdx mice exhibit an abnormal branched phenotype resembling that described in vivo, thus providing an attractive model to study the origin of the pathological defects associated with DMD.

Progress toward finding a cure for muscle diseases has been slow because of the absence of relevant cellular models and the lack of a reliable source of muscle progenitors for biomedical investigation. Here we report an optimized serum-free differentiation protocol to efficiently produce striated, millimeter-long muscle fibers together with satellite-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in vitro. By mimicking key signaling events leading to muscle formation in the embryo, in particular the dual modulation of Wnt and bone morphogenetic protein (BMP) pathway signaling, this directed differentiation protocol avoids the requirement for genetic modifications or cell sorting. Robust myogenesis can be achieved in vitro within 1 month by personnel experienced in hPSC culture. The differentiating culture can be subcultured to produce large amounts of myogenic progenitors amenable to numerous downstream applications. Beyond the study of myogenesis, this differentiation method offers an attractive platform for the development of relevant in vitro models of muscle dystrophies and drug screening strategies, as well as providing a source of cells for tissue engineering and cell therapy approaches.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a devastating genetic disease leading to degeneration of skeletal muscles and premature death. How dystrophin absence leads to muscle wasting remains unclear. Here, we describe an optimized protocol to differentiate human induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) to a late myogenic stage. This allows to recapitulate classical DMD phenotypes (mislocalization of proteins of the Dystrophin-glycoprotein associated complex (DGC), increased fusion, myofiber branching, force contraction defects and calcium hyperactivation) in isogenic DMD-mutant iPSC lines in vitro . Treatment of the myogenic cultures with prednisolone (the standard of care for DMD) can dramatically rescue force contraction, fusion and branching defects in DMD iPSC lines. This argues that prednisolone acts directly on myofibers, challenging the largely prevalent view that its beneficial effects are due to anti-inflammatory properties. Our work introduces a new human in vitro model to study the onset of DMD pathology and test novel therapeutic approaches.

ABSTRACT Brown adipocytes represent a specialized type of mammalian adipocytes able to uncouple nutrient catabolism from ATP generation to dissipate energy as heat. They play an important role in mammals, allowing non-shivering thermogenesis to regulate body temperature in response to cold exposure. In humans, the brown fat tissue is composed of small discrete depots found mostly throughout the neck and trunk region. Increasing brown fat activity either with drug treatment or cell therapy is considered a potential approach for the treatment of metabolic syndrome and obesity. The recent development of in vitro differentiation strategies relying on human pluripotent stem cells (hPSCs) offers the possibility to produce unlimited amounts of brown adipocytes. A strategy efficiently applied to several tissues is to recapitulate step by step the development of the tissue of interest by exposing hPSCs to the signaling cues used during normal embryonic development. However, this strategy has proven difficult to implement for brown fat as the development of this tissue is poorly understood. Here, we first used single cell RNA sequencing to characterize the development of interscapular brown fat in mouse. Our analysis identified a previously unrecognized population of brown adipocytes precursors characterized by expression of the transcription factor GATA6. We show that this precursor population can be efficiently generated from paraxial mesoderm precursors differentiated in vitro from hPSCs by modulating the signaling pathways identified in our transcriptomic analysis. These precursors can in turn be efficiently converted into functional brown adipocytes which can respond to adrenergic stimuli by increasing their metabolism resulting in heat production.

ESCs can adopt lineage-specific gene expression programs by stepwise exposure to defined factors, resulting in the generation of functional cell types. Bulk and single cell-based assays were employed to catalogue gene expression, histone modifications, chromatin conformation, and accessibility transitions in ESC populations and individual cells acquiring a presomitic mesoderm fate and undergoing further lineage specification. These assays identified cis-regulatory regions and transcription factors presiding gene expression programs occurring at defined ESC transitions and revealed the presence of heterogeneous cell populations within discrete ESC developmental stages. The datasets were employed to identify previously unappreciated genomic elements directing the initial activation of Pax7 and myogenic and neurogenic gene expression programs. This study provides a resource for the discovery of genomic and transcriptional features of pluripotent, mesoderm-induced ESCs, and ESCs-derived cell lineages.

Mammalian embryos transiently exhibit aerobic glycolysis (Warburg effect), a metabolic adaptation also observed in cancer cells. The role of this particular type of metabolism during vertebrate organogenesis is currently unknown. Here, we provide evidence for spatio-temporal regulation of aerobic glycolysis in the posterior region of mouse and chicken embryos. We show that a posterior glycolytic gradient is established in response to graded transcription of glycolytic enzymes downstream of FGF signaling. We demonstrate that glycolysis controls posterior elongation of the embryonic axis by regulating cell motility in the presomitic mesoderm and by controling specification of the paraxial mesoderm fate in the tail bud. Our results suggest that Warburg metabolism in the tail bud coordinates Wnt and FGF signaling to promote elongation of the embryonic axis.

Vertebrate segmentation is characterized by the periodic formation of epithelial somites from the mesenchymal presomitic mesoderm (PSM). How the rhythmic signaling pulse delivered by the Segmentation Clock is translated into the periodic morphogenesis of somites remains poorly understood. Here, we focused on the role of Paraxial protocadherin (PAPC/Pcdh8) in this process. We show that in chicken and mouse embryos, PAPC expression is tightly regulated by the Clock and Wavefront system in the posterior PSM. We observed that PAPC exhibits a striking complementary pattern to N-Cadherin (CDH2), marking the interface of the future somite boundary in the anterior PSM. Gain and loss of function of PAPC in chicken embryos disrupt somite segmentation by altering the CDH2-dependent epithelialization of PSM cells. Our data suggest that clathrin-mediated endocytosis is increased in PAPC expressing cells, subsequently affecting CDH2 internalization in the anterior compartment of the future somite. This in turn generates a differential adhesion interface, allowing formation of the acellular fissure that defines the somite boundary. Thus periodic expression of PAPC downstream of the Segmentation Clock triggers rhythmic endocytosis of CDH2, allowing for segmental de-adhesion and individualization of somites.

In vertebrates, body skeletal muscles and axial skeleton derive from the paraxial mesoderm which flanks the neural tube and notochord. The paraxial mesoderm forms in the posterior region of the embryo as presomitic mesoderm (PSM), which generates the embryonic segments called somites. Here, we characterized gene signatures identified using microarray series from the mouse PSM and compared the PSM transcriptome dynamics to that of the developing neural tube. In contrast to the PSM where an abrupt transcriptome reorganisation occurs at the level of the determination front, we show that transcriptome changes are progressive during parallel stages of neural tube differentiation. We show that these early differentiation stages of the paraxial mesoderm can be efficiently recapitulated in monolayer culture in vitro using murine Embryonic Stem (ES) cells. We describe a serum-containing protocol which parallels in vivo tissue maturation allowing differentiation of ES cells towards a paraxial mesoderm fate. We show that R-spondin treatment or Wnt activation alone can induce posterior PSM markers in both mouse and human ES/iPS cells but acquisition of a committed posterior PSM fate requires BMP inhibition to prevent induced cells to drift to a lateral plate mesoderm identity. We show that posterior PSM-like cells induced from mouse ES cells can be further differentiated in vitro to acquire an anterior PSM Pax3-positive identity. When grafted into injured adult muscle, these induced PSM-like precursors generated large numbers of immature muscle fibers. We further show that exposing ES-derived PSM-like cells to a brief FGF inhibition step followed by culture in horse serum-containing medium allows efficient recapitulation of the myogenic program. Differentiating ES cells first produce mononucleated embryonic myocytes and subsequently multinucleated myotubes, as well as Pax7-positive cells. The protocol described here results in improved differentiation and maturation of mouse muscle fibers differentiated in vitro over serum-free protocols. It provides an efficient system for the study of myogenic processes otherwise difficult to study in vivo such as fusion or satellite cell differentiation.