ABSTRACT Massively parallel sequencing of 16S rRNA genes enables the comparison of terrestrial, aquatic, and host-associated microbial communities with sufficient sequencing depth for robust assessments of both alpha and beta diversity. Establishing standardized protocols for the analysis of microbial communities is dependent on increasing the reproducibility of PCR-based molecular surveys by minimizing sources of methodological bias. In this study, we tested the effects of template concentration, pooling of PCR amplicons, and sample preparation/interlane sequencing on the reproducibility associated with paired-end Illumina sequencing of bacterial 16S rRNA genes. Using DNA extracts from soil and fecal samples as templates, we sequenced pooled amplicons and individual reactions for both high (5- to 10-ng) and low (0.1-ng) template concentrations. In addition, all experimental manipulations were repeated on two separate days and sequenced on two different Illumina MiSeq lanes. Although within-sample sequence profiles were highly consistent, template concentration had a significant impact on sample profile variability for most samples. Pooling of multiple PCR amplicons, sample preparation, and interlane variability did not influence sample sequence data significantly. This systematic analysis underlines the importance of optimizing template concentration in order to minimize variability in microbial-community surveys and indicates that the practice of pooling multiple PCR amplicons prior to sequencing contributes proportionally less to reducing bias in 16S rRNA gene surveys with next-generation sequencing.

Abstract Microbial colonization of the human intestine impacts host metabolism and immunity, however when colonization occurs is unclear. Although numerous studies have reported bacterial DNA in first-pass meconium samples, these samples are collected hours to days after birth. We investigated whether bacteria could be detected in meconium prior to birth. Fetal meconium (n = 20) was collected by rectal swab during elective breech Cesarean sections without labour prior to antibiotics and compared to technical and procedural controls (n = 5), first-pass meconium (neonatal meconium; n = 14), and infant stool (n = 25). Unlike first-pass meconium, no microbial signal distinct from negative controls was detected in fetal meconium by 16S rRNA gene sequencing. Additionally, positive aerobic (n = 10 of 20) and anaerobic (n = 12 of 20) clinical cultures of fetal meconium (13 of 20 samples positive in at least one culture) were identified as likely skin contaminants, most frequently Staphylococcus epidermidis , and not detected by sequencing in most samples (same genera detected by culture and sequencing in 2 of 13 samples with positive culture). We conclude that fetal gut colonization does not occur before birth, and that microbial profiles of neonatal meconium reflect populations acquired during and after birth.

ABSTRACT Paternal obesity predisposes offspring to metabolic dysfunction, but the underlying mechanisms remain unclear. We investigated whether paternal obesity-induced offspring metabolic dysfunction is associated with placental endoplasmic reticulum (ER) stress and impaired vascular development. We determined whether offspring glucose intolerance is fueled by ER stress-mediated changes in fetal hepatic development. Furthermore, we also determined whether paternal obesity may indirectly affect in utero development by disrupting maternal metabolic adaptations to pregnancy. Male mice fed a standard chow diet (CON; 17% kcal fat) or high fat diet (PHF; 60% kcal fat) for 8-10 weeks were time-mated with control female mice to generate pregnancies and offspring. Glucose tolerance in pregnant females was evaluated at mid-gestation (embryonic day (E) 14.5) and term gestation (E18.5). At E14.5 and E18.5, fetal liver and placentae were collected, and markers of hypoxia, angiogenesis, endocrine function, and macronutrient transport, and unfolded protein response (UPR) regulators were evaluated to assess ER stress. Young adult offspring glucose tolerance and metabolic parameters were assessed at ∼60 days of age. Paternal obesity did not alter maternal glucose tolerance or placental lactogen in pregnancy but did induce placental hypoxia, ER stress, and altered placental angiogenesis. This effect was most pronounced in placentae associated with female fetuses. Consistent with this, paternal obesity also activated the ATF6 and PERK branches of the UPR in fetal liver and altered hepatic expression of gluconeogenic factors at E18.5. Adult offspring of obese fathers showed glucose intolerance and impaired whole-body energy metabolism, particularly in female offspring. Thus, paternal obesity programs sex-specific adverse placental structural and functional adaptations and alters fetal hepatic development via ER stress-induced pathways. These changes likely underpin metabolic deficits in adult offspring. Summary Sentence Paternal obesity alters placental vascular structures and is associated with sex-specific compromises in glucose tolerance and metabolism in young offspring

Abstract It is clear that the gastrointestinal tract influences metabolism and immune function. Most studies to date have used male test subjects, with a focus on effects of obesity and dietary challenges. Despite significant physiological adaptations that occur across gestation, relatively few studies have examined pregnancy-related gut function. In this study, we investigated the impacts of pregnancy and adiposity on maternal intestinal epithelium morphology, in vivo intestinal permeability, and peripheral blood immunophenotype, using control (CTL) and high-fat (HF) fed non-pregnant female mice and pregnant mice at mid-(embryonic day (E)14.5) and late (E18.5) gestation. We found that small intestine length increased between non-pregnant mice and dams at late-gestation, but ileum villus length, and ileum and colon crypt depths and goblet cell numbers remained similar. Compared to CTL-fed mice, HF-fed mice had reduced small intestine length, ileum crypt depth and villus length. Goblet cell numbers were only consistently reduced in HF-fed non-pregnant mice. Pregnancy increased in vivo gut permeability, with a greater effect at mid-versus late-gestation. Non-pregnant HF-fed mice had greater gut permeability, and permeability was also increased in HF-fed pregnant dams at mid but not late-gestation. The impaired maternal gut barrier in HF-fed dams at mid-gestation coincided with changes in maternal blood and bone marrow immune cell composition, including an expansion of circulating inflammatory Ly6C high monocytes. In summary, pregnancy has temporal effects on maternal intestinal structure and barrier function, and on peripheral immunophenotype, which are further modified by HF diet-induced maternal adiposity.

Abstract Pregnancy requires maternal adaptations to support fetal growth: whether these adaptations include temporal shifts in the gut microbiome is still unclear. We investigated the maternal gut microbiome longitudinally over the course of pregnancy and the impact of pre-pregnancy BMI (pBMI) and GWG. We also determined whether parity modulated observed associations. We show that the gut microbiota of participants with higher pBMI changed less over the course of pregnancy in primiparous, but not multiparous participants. This suggests that previous pregnancies may have persistent impacts on maternal adaptations to pregnancy. This ecological memory appears to be passed to the next generation, as parity modulated the impact of maternal GWG on the infant gut microbiome. This work supports a role for the gut microbiome in maternal adaptations to pregnancy and highlights the need for longitudinal sampling and accounting for parity as key considerations for studies of the microbiome in pregnancy and infants.

Shifts in maternal intestinal microbiota have been implicated in metabolic adaptations to pregnancy. We have previously shown a pregnancy-by-diet interaction effect on intestinal microbiota in mice. In this project we investigated how high-fat diet impacts the maternal gut microbiota, intestinal inflammation and gut barrier integrity, placental inflammation, and fetal intestinal development at E18.5. High-fat diet was associated with decreased relative abundances of SCFA producers during pregnancy. These diet-induced shifts paralleled decreased maternal intestinal mRNA levels of SCFA receptor Gpr41, modestly decreased cecal butyrate, and altered mRNA levels of inflammatory cytokines and immune cell markers in the maternal intestine. Maternal high-fat diet resulted in impaired gut barrier integrity, with corresponding increases in circulating maternal levels of LPS and TNF. Placentas of high-fat dams demonstrated blood vessel immaturity and hypoxia, decreased free carnitine, acylcarnitine derivatives, trimethylamine-N-oxide, as well as altered mRNA levels of inflammation, autophagy and ER stress markers. High-fat diet exposed fetuses had increased activation of NF-κB and inhibition of the unfolded protein response in the developing intestine. Together, these data suggest that high-fat intake prior to and during pregnancy shifts the composition of the maternal gut microbiota and impairs gut barrier integrity, resulting in increased circulating LPS, which may ultimate contribute to changes in placental vascularization and fetal gut development.