Most tumours have an aberrantly activated lipid metabolism1,2 that enables them to synthesize, elongate and desaturate fatty acids to support proliferation. However, only particular subsets of cancer cells are sensitive to approaches that target fatty acid metabolism and, in particular, fatty acid desaturation3. This suggests that many cancer cells contain an unexplored plasticity in their fatty acid metabolism. Here we show that some cancer cells can exploit an alternative fatty acid desaturation pathway. We identify various cancer cell lines, mouse hepatocellular carcinomas, and primary human liver and lung carcinomas that desaturate palmitate to the unusual fatty acid sapienate to support membrane biosynthesis during proliferation. Accordingly, we found that sapienate biosynthesis enables cancer cells to bypass the known fatty acid desaturation pathway that is dependent on stearoyl-CoA desaturase. Thus, only by targeting both desaturation pathways is the in vitro and in vivo proliferation of cancer cells that synthesize sapienate impaired. Our discovery explains metabolic plasticity in fatty acid desaturation and constitutes an unexplored metabolic rewiring in cancers. In several human and mouse cancer cell lines and carcinomas, a sapienate biosynthesis pathway underpins metabolic plasticity by allowing these cells to bypass stearoyl-CoA desaturase-dependent fatty acid desaturation.

Isabelle Janoueix-Lerosey, Valentina Boeva and colleagues analyze the super-enhancer landscape of 25 neuroblastoma cell lines to define core regulatory circuits controlling gene expression programs. They find and functionally characterize two types of cell identity that contribute to the tumor heterogeneity of neuroblastoma. Neuroblastoma is a tumor of the peripheral sympathetic nervous system1, derived from multipotent neural crest cells (NCCs). To define core regulatory circuitries (CRCs) controlling the gene expression program of neuroblastoma, we established and analyzed the neuroblastoma super-enhancer landscape. We discovered three types of identity in neuroblastoma cell lines: a sympathetic noradrenergic identity, defined by a CRC module including the PHOX2B, HAND2 and GATA3 transcription factors (TFs); an NCC-like identity, driven by a CRC module containing AP-1 TFs; and a mixed type, further deconvoluted at the single-cell level. Treatment of the mixed type with chemotherapeutic agents resulted in enrichment of NCC-like cells. The noradrenergic module was validated by ChIP-seq. Functional studies demonstrated dependency of neuroblastoma with noradrenergic identity on PHOX2B, evocative of lineage addiction. Most neuroblastoma primary tumors express TFs from the noradrenergic and NCC-like modules. Our data demonstrate a previously unknown aspect of tumor heterogeneity relevant for neuroblastoma treatment strategies.

Abstract Metastases are the leading cause of mortality in patients with cancer. Metastasis formation requires cancer cells to adapt their cellular phenotype. However, how metabolism supports this adaptation of cancer cells is poorly defined. We use 2D versus 3D cultivation to induce a shift in the cellular phenotype of breast cancer cells. We discover that proline catabolism via proline dehydrogenase (Prodh) supports growth of breast cancer cells in 3D culture. Subsequently, we link proline catabolism to in vivo metastasis formation. In particular, we find that PRODH expression and proline catabolism is increased in metastases compared to primary breast cancers of patients and mice. Moreover, inhibiting Prodh is sufficient to impair formation of lung metastases in the orthotopic 4T1 and EMT6.5 mouse models, without adverse effects on healthy tissue and organ function. In conclusion, we discover that Prodh is a potential drug target for inhibiting metastasis formation.

ABSTRACT Cell lines have been essential for major discoveries in cancer including Ewing sarcoma (EwS). EwS is a highly aggressive pediatric bone or soft-tissue cancer characterized by oncogenic EWSR1-ETS fusion transcription factors converting polymorphic GGAA-microsatellites (mSats) into neo-enhancers. However, further detailed mechanistic evaluation of gene regulation in EwS have been hindered by the limited number of well-characterized cell line models. Here, we present the Ewing Sarcoma Cell Line Atlas (ESCLA) comprising 18 EwS cell lines with inducible EWSR1-ETS knockdown that were profiled by whole-genome-sequencing, DNA methylation arrays, gene expression and splicing arrays, mass spectrometry-based proteomics, and ChIP-seq for EWSR1-ETS and histone marks. Systematic analysis of these multi-dimensional data illuminated hundreds of new potential EWSR1-ETS target genes, the nature of EWSR1-ETS-preferred GGAA-mSats, and potential indirect modes of EWSR1-ETS-mediated gene regulation. Moreover, we identified putative co-regulatory transcription factors and heterogeneously regulated EWSR1-ETS target genes that may have implications for the clinical heterogeneity of EwS. Collectively, our freely available ESCLA constitutes an extremely rich resource for EwS research and highlights the power of leveraging multidimensional and comprehensive datasets to unravel principles of heterogeneous gene regulation by dominant fusion oncogenes.

Abstract Cancer metastasis requires the transient activation of cellular programs enabling dissemination and seeding in distant organs. Genetic, transcriptional and translational intra-tumor heterogeneity contributes to this dynamic process. Beyond this, metabolic intra-tumor heterogeneity has also been observed, yet its role for cancer progression remains largely elusive. Here, we discovered that intra-tumor heterogeneity in phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH) protein expression drives breast cancer cell dissemination and metastasis formation. Specifically, we observed intra-tumor heterogeneous PHGDH expression in primary breast tumors, with low PHGDH expression being indicative of metastasis in patients. In mice, Phgdh protein, but not mRNA, expression is low in circulating tumor cells and early metastatic lesions, leading to increased dissemination and metastasis formation. Mechanistically, low PHGDH protein expression induces an imbalance in glycolysis that can activate sialic acid synthesis. Consequently, cancer cells undergo a partial EMT and show increased p38 as well as SRC phosphorylation, which activate cellular programs of dissemination. In turn, inhibition of sialic acid synthesis through knock-out of cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid synthetase (CMAS) counteracts the increased cancer cell dissemination and metastasis induced by low PHGDH expression. In conclusion, we find that heterogeneity in PHGDH protein expression promotes cancer cell dissemination and metastasis formation.

ABSTRACT Purpose Ewing sarcoma (EwS) is a highly aggressive bone- or soft tissue-associated malignancy mostly affecting children, adolescents, and young adults. Although multimodal therapies have strongly improved patients’ overall survival over the past decades, the development of prognostic biomarkers for risk-based patient stratification and more effective therapies with less adverse effects is stagnating. Thus, new personalized medicine approaches are urgently required. Experimental design Gene expression data of EwS and normal tissues were crossed with survival data to identify highly overexpressed, prognostically relevant, and actionable potential targets. RNA-interference and dose-response assays as well as tissue-microarray analyses were carried out to explore the functional role and druggability of a prominent candidate gene in vitro and in vivo , and to validate its suitability as a prognostic biomarker. Results Employing a multilayered screening approach, we discover ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 (RRM2) as a promising therapeutic target and prognostic biomarker in EwS. Through analysis of two independent EwS patient cohorts, we show that RRM2 mRNA and protein overexpression is associated with an aggressive clinical phenotype and poor patients’ overall survival. In agreement, RRM2 silencing as well as pharmacological inhibition by the specific inhibitor triapine (3-AP) significantly reduces EwS growth in vitro and in vivo . Furthermore, we present evidence that pharmacological RRM2 inhibition by triapine can overcome chemoresistance against doxorubicin or gemcitabine, and synergize with cell cycle checkpoint inhibitors (CHEK1 or WEE1). Conclusions Based on the aggressive phenotype mediated by and the druggability of RRM2 our results provide a translational rationale for exploiting RRM2 as a novel therapeutic target in EwS and prompt further clinical investigations.

ABSTRACT Chromosome 8 (chr8) gains are common in cancer. However, their potential contribution to tumor heterogeneity is largely unexplored. Ewing sarcoma (EwS) is characterized by pathognomonic FET::ETS fusions, but show a general paucity of other recurrent somatic mutations that could explain the observed clinical diversity. In EwS, chr8 gains are the second most common genetic alteration rendering EwS an ideal model to investigate the relevance of chr8 gains in an otherwise silent genomic context. Here, we report that chr8 gain-driven gene expression patterns correlate with poor overall survival of EwS patients. This effect is predominantly mediated by increased expression of the translation initiation factor binding protein 4E-BP1 encoded by EIF4EBP1 on chr8. High EIF4EBP1 expression showed the strongest association with poor overall patient survival among all chr8-encoded genes and correlated with chr8 gains in EwS tumors. Similar findings were made in numerous entities of The Cancer Genome Atlas (TCGA). In the EwS model, silencing of 4E-BP1 reduced cell proliferation, clonogenicity, spheroidal growth in vitro , and tumorigenesis in vivo . Integrated multi- omics profiling uncovered that 4E-BP1 orchestrates a multifunctional proteomic network including hubs affecting RNA processing, translational regulation, and chromatin modification. Drug screens and functional assays revealed that high 4E-BP1 expression sensitizes for pharmacological CDK4/6 inhibition in preclinical models. Collectively, we establish chr8 gains and high 4E-BP1 expression as prognostic biomarkers in EwS and demonstrate that their association with poor patient outcome is primarily mediated by 4E-BP1 orchestrating a multifunctional proteomic network sensitizing EwS for CDK4/6 inhibitors. Our data suggest that testing for chr8 gain may improve risk-stratification and therapeutic management in EwS and other cancers.

Deciphering principles of inter-individual tumor heterogeneity is essential for refinement of personalized anti-cancer therapy. Unlike cancers of adulthood, pediatric malignancies including Ewing sarcoma (EwS) feature a striking paucity of somatic alterations except for pathognomonic driver-mutations that cannot explain overt variations in clinical outcome. Here we demonstrate in the EwS model how cooperation of a dominant oncogene and regulatory variants determine tumor growth, patient survival and drug response. We show that binding of the oncogenic EWSR1-FLI1 fusion transcription factor to a polymorphic enhancer-like DNA element controls expression of the transcription factor MYBL2, whose high expression promotes poor patient outcome via activation of pro-proliferative signatures. Analysis of paired germline and tumor whole-genome sequencing data revealed that regulatory variability at this locus is inherited via the germline. CRISPR-mediated interference with this regulatory element almost abolished MYBL2 transcription, and MYBL2 knockdown decreased cell proliferation, cell survival and tumorigenicity of EwS cells. Combined RNA- and ChIP-seq analyses as well as functional experiments and clinical data identified CCNF, BIRC5 and AURKB as direct MYBL2 targets and critical mediators of its phenotype. In drug-response experiments, high MYBL2 levels sensitized EwS cells for inhibition of its activating cyclin dependent kinase CDK2 in vitro and in vivo, suggesting MYBL2 as a predictive biomarker for targeted anti-CDK2-therapy. Collectively, our findings establish cooperation of somatic mutations and regulatory germline variants as a major determinant of tumor progression and indicate the importance of integrating the regulatory genome in the process of developing new diagnostic and/or therapeutic strategies to fully harness the potential of precision medicine.

Background: Prostate adenocarcinoma (PCa) with/without the TMPRSS2-ERG (T2E) fusion represent distinct molecular subtypes. Objective: To investigate gene-signatures associated with metastasis in T2E-positive and -negative PCa, and to identify and validate subtype-specific prognostic biomarkers. Design, setting and participants: Gene expression and clinicopathological data of two discovery PCa cohorts (total n=783) were separately analyzed regarding the T2E status. Selected subtype-specific biomarkers were validated in two additional cohorts (total n=405). Outcome measurements and statistical analysis: From both discovery cohorts, we generated two gene lists ranked by their differential intratumoral expression in patients with/without metastases stratified by T2E-status, which were subjected to gene set enrichment and leading edge analyses. The resulting top 20 gene-signatures of both gene lists associated with metastasis were analyzed for overlaps between T2E-positive and -negative cases. Genes shared by several functional gene-signatures were tested for their association with event-free survival using the Kaplan-Meier method in a validation cohort. Immunohistochemistry was performed in another validation cohort. Results and limitations: Metastatic T2E-positive and -negative PCa are characterized by different gene-signatures. Five genes (ASPN, BGN, COL1A1, RRM2 and TYMS) were identified whose high expression was significantly associated with worse outcome exclusively in T2E-negative PCa. This was validated in an independent cohort for all genes and additionally for RRM2 by immunohistochemistry in a separate validation cohort. No prognostic biomarkers were identified exclusively for T2E-positive tumors. Conclusions: Our study demonstrates that the prognostic value of biomarkers critically depends on the molecular subtype, i.e. the T2E-status, which should be considered when screening for and applying novel prognostic biomarkers for outcome prediction in PCa. Patient summary: Outcome prediction for PCa is complex. The results of this study highlight that the validity of prognostic biomarkers depends on the molecular subtype, specifically the presence/absence of T2E. The reported new subtype-specific biomarkers exemplify that biomarker based outcome prediction in PCa should consider the T2E-status.

Oncogenesis of Ewing sarcoma (EwS), the second most common malignant bone tumor of childhood and adolescence, is dependent on the expression of chimeric EWSR1-ETS fusion oncogenes, most often EWSR1-FLI1 (E/F).E/F expression leads to dysregulation of focal adhesions (FAs) enhancing the migratory capacity of EwS cells. Here we show that, in EwS cell lines and tissue samples, focal adhesion kinase (FAK) is expressed and phosphorylated at Y397 in an E/F-dependent way involving Ezrin. Employing different EwS cell as in vitro models, we found that key malignant properties of E/F are mediated via substrate-independent autophosphorylation of FAK on Y397. This phosphorylation results in enhanced FA formation, Rho-dependent cell migration, and impaired caspase-3-mediated apoptosis in vitro . Conversely, treatment with the FAK inhibitor Y15 enhanced caspase-mediated apoptosis and EwS cell migration, independent from the respective EWSR1-ETS fusion type, mimicking an anoikis-like phenotype. Our findings were confirmed in vivo using an avian chorioallantoic membrane (CAM) model. Our results provide a first rationale for the therapeutic use of FAK inhibitors to impair metastatic dissemination of EwS.