The expression profiles and spatial distributions of RNAs regulate many cellular functions. Image-based transcriptomic approaches provide powerful means to measure both expression and spatial information of RNAs in individual cells within their native environment. Among these approaches, multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH) has achieved spatially resolved RNA quantification at transcriptome scale by massively multiplexing single-molecule FISH measurements. Here, we increased the gene throughput of MERFISH and demonstrated simultaneous measurements of RNA transcripts from ∼10,000 genes in individual cells with ∼80% detection efficiency and ∼4% misidentification rate. We combined MERFISH with cellular structure imaging to determine subcellular compartmentalization of RNAs. We validated this approach by showing enrichment of secretome transcripts at the endoplasmic reticulum, and further revealed enrichment of long noncoding RNAs, RNAs with retained introns, and a subgroup of protein-coding mRNAs in the cell nucleus. Leveraging spatially resolved RNA profiling, we developed an approach to determine RNA velocity in situ using the balance of nuclear versus cytoplasmic RNA counts. We applied this approach to infer pseudotime ordering of cells and identified cells at different cell-cycle states, revealing ∼1,600 genes with putative cell cycle-dependent expression and a gradual transcription profile change as cells progress through cell-cycle stages. Our analysis further revealed cell cycle-dependent and cell cycle-independent spatial heterogeneity of transcriptionally distinct cells. We envision that the ability to perform spatially resolved, genome-wide RNA profiling with high detection efficiency and accuracy by MERFISH could help address a wide array of questions ranging from the regulation of gene expression in cells to the development of cell fate and organization in tissues.

Imaging membranes in live cells with nanometer-scale resolution promises to reveal ultrastructural dynamics of organelles that are essential for cellular functions. In this work, we identified photoswitchable membrane probes and obtained super-resolution fluorescence images of cellular membranes. We demonstrated the photoswitching capabilities of eight commonly used membrane probes, each specific to the plasma membrane, mitochondria, the endoplasmic recticulum (ER) or lysosomes. These small-molecule probes readily label live cells with high probe densities. Using these probes, we achieved dynamic imaging of specific membrane structures in living cells with 30–60 nm spatial resolution at temporal resolutions down to 1–2 s. Moreover, by using spectrally distinguishable probes, we obtained two-color super-resolution images of mitochondria and the ER. We observed previously obscured details of morphological dynamics of mitochondrial fusion/fission and ER remodeling, as well as heterogeneous membrane diffusivity on neuronal processes.

Abstract The human cerebral cortex has tremendous cellular diversity and complex cellular organization that are essential for brain function. How different types of cells are organized and interact with each other in the human cortex, and how cellular organizations and interaction patterns vary across species are, however, unclear. Here, we performed spatially resolved single-cell expression profiling of 4,000 genes in human middle and superior temporal gyrus using multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). We identified >100 neuronal and non-neuronal cell populations with distinct transcriptional signatures, generated a molecularly defined and spatially resolved cell atlas of these brain regions, and analyzed cell-cell interactions in a cell-type-specific manner. Comparison with the mouse cortex showed conservation in the laminar organization of cells and substantial divergence in cell-cell interactions between human and mouse. Notably, our data revealed a drastic increase in interactions between neurons and non-neuronal cells in the human cortex, uncovered human-specific cell-cell interaction patterns, and identified potential ligand-receptor basis of microglia-neuron interactions.

Abstract Actin, spectrin, and associated molecules form a membrane-associated periodic skeleton (MPS) in neurons. The molecular composition and functions of the MPS remain incompletely understood. Here, using co-immunoprecipitation and mass spectrometry, we identified hundreds of candidate MPS-interacting proteins that span diverse functional categories. We validated representative proteins in several of these categories, including previously unknown MPS structural components, as well as motor proteins, cell adhesion molecules, ion channels, and signaling proteins, demonstrating periodic distributions of ∼20 proteins in neurons using super-resolution imaging. Genetic perturbations of the MPS and its interacting proteins further suggested functional roles of the MPS in axon-axon and axon-dendrite interactions and in axon diameter regulation, and implicated the involvement of MPS interactions with cell adhesion molecules and non-muscle myosin in these roles. These results provide new insights into the interactome of the MPS, and suggest new functions of the MPS in neurons.

Summary: The Imaging and Molecular Annotation of Xenografts and Tumors Cancer Grand Challenges team was set up with the objective of developing the “next generation” of pathology and cancer research by using a combination of single-cell and spatial omics tools to produce 3D molecularly annotated maps of tumors. Its activities overlapped, and in some cases catalyzed, a spatial revolution in biology that saw new technologies being deployed to investigate the roles of tumor heterogeneity and of the tumor micro-environment. See related article by Stratton et al., p. 22 See related article by Bhattacharjee et al., p. 28 See related article by Goodwin et al., p. 34

High-resolution, real-time imaging of RNA is essential for understanding the diverse, dynamic behaviors of individual RNA molecules in single cells. However, single-molecule live-cell imaging of unmodified endogenous RNA has not yet been achieved. Here, we present single-molecule live-cell fluorescence

Yak (Bos grunniens), a special breed of cattle on the Qinghai–Tibet Plateau, has low fertility due to nutritional deficiency, especially the trace elements. The steroid hormones estradiol (E2) and progesterone (P4) synthesized by yak follicular granulosa cells (BGCs) are involved in the entire reproductive process. In the present study, we investigated the effects of trace elements and vitamins on yak follicular GCs, including the cellular activity, the synthesis of E2 and P4, and the expression of genes related to steroid hormone synthesis. The results showed that moderate supplementation of vitamin D3 (VD3), strontium (Sr), manganese (Mn), and selenium (Se) enhanced granulosa cell activity. Within the safe dose range, the addition of vitamin A (VA), VD3, cobalt (Co), Sr, copper (Cu), Mn, Se, and chromium (Cr) significantly increased the synthesis of E2 by GCs, while the addition of VA, vitamin C (VC), VE, zinc (Zn), Sr, Cu, and Cr enhanced the production of P4 in GCs. The changes in steroid synthesizing genes were consistent with the changes in hormone synthesis. This study provides an experimental basis for the addition of trace elements to improve the production performance of yaks.

Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH) allows simultaneous imaging of numerous RNA species in their native cellular environment and hence spatially resolved single-cell transcriptomic measurements. However, the relatively modest brightness of signals from single RNA molecules can become limiting in a number of important applications, such as increasing the imaging throughput, imaging shorter RNAs, and imaging samples with high degrees of background, such as some tissue samples. Here, we introduce a branched DNA (bDNA) amplification approach for MERFISH measurements. This approach produces a drastic signal increase in RNA FISH samples without increasing the fluorescent spot size for individual RNAs or increasing the variation in brightness from spot to spot. Using this approach in combination with MERFISH, we demonstrated RNA imaging and profiling with a near 100% detection efficiency. We further demonstrated that signal amplification improves MERFISH performance when fewer FISH probes are used for each RNA species, which should allow shorter RNAs to be imaged. We anticipate that the combination of bDNA amplification with MERFISH should facilitate many other applications and extend the range of biological questions that can be addressed by this technique in both cell culture and tissues.