In the past few years, 3D electron microscopy (3DEM) has undergone a revolution in instrumentation and methodology. One of the central players in this wide-reaching change is the continuous development of image processing software. Here we present Scipion, a software framework for integrating several 3DEM software packages through a workflow-based approach. Scipion allows the execution of reusable, standardized, traceable and reproducible image-processing protocols. These protocols incorporate tools from different programs while providing full interoperability among them. Scipion is an open-source project that can be downloaded from http://scipion.cnb.csic.es.

X-windows based microscopy image processing package (Xmipp) is a specialized suit of image processing programs, primarily aimed at obtaining the 3D reconstruction of biological specimens from large sets of projection images acquired by transmission electron microscopy. This public-domain software package was introduced to the electron microscopy field eight years ago, and since then it has changed drastically. New methodologies for the analysis of single-particle projection images have been added to classification, contrast transfer function correction, angular assignment, 3D reconstruction, reconstruction of crystals, etc. In addition, the package has been extended with functionalities for 2D crystal and electron tomography data. Furthermore, its current implementation in C++, with a highly modular design of well-documented data structures and functions, offers a convenient environment for the development of novel algorithms. In this paper, we present a general overview of a new generation of Xmipp that has been re-engineered to maximize flexibility and modularity, potentially facilitating its integration in future standardization efforts in the field. Moreover, by focusing on those developments that distinguish Xmipp from other packages available, we illustrate its added value to the electron microscopy community.

We describe a collection of standardized image processing protocols for electron microscopy single-particle analysis using the XMIPP software package. These protocols allow performing the entire processing workflow starting from digitized micrographs up to the final refinement and evaluation of 3D models. A particular emphasis has been placed on the treatment of structurally heterogeneous data through maximum-likelihood refinements and self-organizing maps as well as the generation of initial 3D models for such data sets through random conical tilt reconstruction methods. All protocols presented have been implemented as stand-alone, executable python scripts, for which a dedicated graphical user interface has been developed. Thereby, they may provide novice users with a convenient tool to quickly obtain useful results with minimum efforts in learning about the details of this comprehensive package. Examples of applications are presented for a negative stain random conical tilt data set on the hexameric helicase G40P and for a structurally heterogeneous data set on 70S Escherichia coli ribosomes embedded in vitrified ice.

Abstract With the help of novel processing workflows and algorithms, we have obtained a better understanding of the flexibility and conformational dynamics of the SARS-CoV-2 spike in the prefusion state. We have re-analyzed previous cryo-EM data combining 3D clustering approaches with ways to explore a continuous flexibility space based on 3D Principal Component Analysis. These advanced analyses revealed a concerted motion involving the receptor-binding domain (RBD), N-terminal domain (NTD), and subdomain 1 and 2 (SD1 & SD2) around the previously characterized 1-RBD-up state, which have been modeled as elastic deformations. We show that in this dataset there are not well-defined, stable, spike conformations, but virtually a continuum of states moving in a concerted fashion. We obtained an improved resolution ensemble map with minimum bias, from which we model by flexible fitting the extremes of the change along the direction of maximal variance. Moreover, a high-resolution structure of a recently described biochemically stabilized form of the spike is shown to greatly reduce the dynamics observed for the wild-type spike. Our results provide new detailed avenues to potentially restrain the spike dynamics for structure-based drug and vaccine design and at the same time give a warning of the potential image processing classification instability of these complicated datasets, having a direct impact on the interpretability of the results.

Abstract In recent years, advances in cryoEM have dramatically increased the resolution of Coulomb potential maps and, with it, the number of solved atomic models. It is widely accepted that the quality of cryoEM maps varies locally; therefore, the evaluation of the maps-derived structural models must be done locally as well. In this article, a method for the local analysis of the map-to-model fit is presented. The algorithm uses a comparison of two local resolution maps. The first is the local FSC (Fourier shell correlation) between the full map and the model, while the second is calculated between the half maps normally used in typical single particle analysis workflows. We call the new quality measure “FSC-Q”, and it is a quantitative estimation of how much of the model is supported by the signal content of the map. Furthermore, we show that FSC-Q may be helpful to avoid overfitting. It can be used to complement other methods, such as the Q-score method that estimates the resolvability of atoms.

Abstract Little is known about the basic biology of non-human adenoviruses, which could be alternative vectors free of issues posed by preexisting immunity to human adenoviruses. We present the cryo-EM structure of a lizard atadenovirus, LAdV-2, at 3.4 Å resolution. This is the first high resolution structure of an adenovirus with non-mammalian host, and of an adenovirus not belonging to the Mastadenovirus genus. Atadenovirus capsids contain genus specific proteins LH3, p32k, and LH2, and are more thermostable than the more studied human adenoviruses. We find a large conformational difference in the internal vertex protein IIIa between mast- and atadenoviruses, induced by the presence of an extended polypeptide in the region. This polypeptide, as well as α-helical clusters located beneath the icosahedral facet, likely correspond to proteins LH2 and p32k. The external genus specific protein LH3, with a trimeric β-helix fold typical of bacteriophage host attachment proteins, contacts the hexon shell surface via a triskelion structure identical to that used by protein IX in human AdV, revealing a conserved capsid-binding motif and a possible gene duplication event. Altogether, this work shows how the network of minor coat proteins differs between AdV genera and relates to virus evolution and capsid stability properties.

Abstract Enteric adenoviruses are one of the main causes of viral gastroenteritis in the world. To carry out a successful infection, the virions must withstand the harsh conditions found in the gut. This requirement suggests that capsid stability must be different from that of other adenoviruses. We have determined the structure of a human enteric adenovirus, HAdV-F41, at 4.0 Å resolution by single particle averaging cryo-electron microscopy, and compared it with that of other adenoviruses with respiratory (HAdV-C5) and ocular (HAdV-D26) tropisms. While the overall structures of hexon, penton base and internal minor coat proteins IIIa and VIII are conserved, we observe partially ordered elements reinforcing the vertex region, which suggests their role in enhancing the physicochemical capsid stability of HAdV-F41. Unexpectedly, we find an organization of the external minor coat protein IX different from all previously characterized human and non-human mastadenoviruses. Knowledge of the structure of enteric adenoviruses can provide a starting point for the design of vectors suitable for oral delivery or intestinal targeting.

Recent technological advances and computational developments, have allowed the reconstruction of cryo-EM maps at near-atomic resolution structures. Cryo-EM maps benefit significantly of a 'postprocessing' step, normally referred to as 'sharpening', that tends to increase signal at medium/high resolution. Here, we propose a new method for local sharpening of volumes generated by cryo-EM. The algorithm (LocalDeblur) is based on a local resolution-guided Wiener restoration approach, does not need any prior atomic model and it avoids artificial structure factor corrections. LocalDeblur is fully automatic and parameter free. We show that the new method significantly and quantitatively improving map quality and interpretability, especially in cases of broad local resolution changes (as is often the case of membrane proteins).