Abstract With the help of novel processing workflows and algorithms, we have obtained a better understanding of the flexibility and conformational dynamics of the SARS-CoV-2 spike in the prefusion state. We have re-analyzed previous cryo-EM data combining 3D clustering approaches with ways to explore a continuous flexibility space based on 3D Principal Component Analysis. These advanced analyses revealed a concerted motion involving the receptor-binding domain (RBD), N-terminal domain (NTD), and subdomain 1 and 2 (SD1 & SD2) around the previously characterized 1-RBD-up state, which have been modeled as elastic deformations. We show that in this dataset there are not well-defined, stable, spike conformations, but virtually a continuum of states moving in a concerted fashion. We obtained an improved resolution ensemble map with minimum bias, from which we model by flexible fitting the extremes of the change along the direction of maximal variance. Moreover, a high-resolution structure of a recently described biochemically stabilized form of the spike is shown to greatly reduce the dynamics observed for the wild-type spike. Our results provide new detailed avenues to potentially restrain the spike dynamics for structure-based drug and vaccine design and at the same time give a warning of the potential image processing classification instability of these complicated datasets, having a direct impact on the interpretability of the results.

Abstract In recent years, advances in cryoEM have dramatically increased the resolution of Coulomb potential maps and, with it, the number of solved atomic models. It is widely accepted that the quality of cryoEM maps varies locally; therefore, the evaluation of the maps-derived structural models must be done locally as well. In this article, a method for the local analysis of the map-to-model fit is presented. The algorithm uses a comparison of two local resolution maps. The first is the local FSC (Fourier shell correlation) between the full map and the model, while the second is calculated between the half maps normally used in typical single particle analysis workflows. We call the new quality measure “FSC-Q”, and it is a quantitative estimation of how much of the model is supported by the signal content of the map. Furthermore, we show that FSC-Q may be helpful to avoid overfitting. It can be used to complement other methods, such as the Q-score method that estimates the resolvability of atoms.

Recent technological advances and computational developments, have allowed the reconstruction of cryo-EM maps at near-atomic resolution structures. Cryo-EM maps benefit significantly of a 'postprocessing' step, normally referred to as 'sharpening', that tends to increase signal at medium/high resolution. Here, we propose a new method for local sharpening of volumes generated by cryo-EM. The algorithm (LocalDeblur) is based on a local resolution-guided Wiener restoration approach, does not need any prior atomic model and it avoids artificial structure factor corrections. LocalDeblur is fully automatic and parameter free. We show that the new method significantly and quantitatively improving map quality and interpretability, especially in cases of broad local resolution changes (as is often the case of membrane proteins).

Cryo-EM Single Particle Analysis workflows require from tens of thousands of high-quality particle projections to unveil the three-dimensional structure of macromolecules. Conventional methods for automatic particle picking tend to suffer from high false-positive rates, hurdling the reconstruction process. One common cause of this problem is the presence of carbon and different types of high-contrast contaminations. In order to overcome this limitation, we have developed MicrographCleaner, a deep learning package designed to discriminate which regions of micrographs are suitable for particle picking and which are not in an automatic fashion. MicrographCleaner implements a U-net-like deep learning model trained on a manually curated dataset compiled from over five hundred micrographs. The benchmarking, carried out on about one hundred independent micrographs, shows that MicrographCleaner is a very efficient approach for micrograph preprocessing. MicrographCleaner (micrograph\_cleaner\_em) package is available at PyPI and Anaconda Cloud and also as a Scipion/Xmipp protocol. Source code is available at [https://github.com/rsanchezgarc/micrograph\_cleaner\_em][1]. [1]: https://github.com/rsanchezgarc/micrograph_cleaner_em

Single Particle Analysis using cryo-electron microscopy is a structural biology technique to capture the three-dimensional conformation of biological macromolecules. The projection images used to construct the 3D density map are characterized by a very low signal-to-noise ratio to minimize radiation damage in the samples. As a consequence, the 3D alignment process is a challenging and error prone task and this job usually determines the success or failure of the macromolecule reconstruction. In this work, we present a soft-alignment validation approach, which can quantify the alignment precision and accuracy as well as the data homogeneity of the single particles when they are confronted with the resultant reconstructed 3DEM map. We have also applied this method to data homogeneity analysis and particle pruning, improving the data quality and as a consequence the final map resolution.