Abstract Durum wheat ( Triticum turgidum L. subsp. durum ) landraces represent a prominent genetic resource for Mediterranean farming systems and breeding programs. Fourteen landraces sampled in Tunisia were genotyped with 9 microsatellite markers and characterized with 15 morphological descriptors, including resistance to the fungal disease Septoria tritici blotch (STB). The genetic diversity, nearly was as important within landraces populations (45%) than between populations (54%). It was structured in seven genetic groups and was only partly explained by the variety name or the locality of origin. Populations were also greatly diversified phenotypically (Shannon-Weaver H’=0.54) with traits related to spike and awn colours being the most diversified. Resistance to STB was either qualitative in two populations or with varying degrees of quantitative resistance in the others. A P st -F st comparison indicate a local adaptation of the populations. Overall, the genetic structure of Tunisian durum wheat landraces revealed a complex selection trajectory and seed exchanges between farmers.

Abstract In order to better understand the Fusarium head blight disease, reliable real-time PCR assays for detection and quantification of fungal species belonging to the Fusarium and Microdochium genus are needed. Specific qPCR assays were developed for nine of those species. All criteria required for reproducing the assays are presented. The assays were species specific and allow quantification of at least 5 pg of fungal DNA and detection of 0.5 pg of fungal DNA per PCR reaction. Moreover we showed that the quantification performances of the tests were not altered in the presence of DNA of closely related species in the sample. The assays were tested on field samples and have been already used in greenhouse experiments.

Abstract Cultivar mixtures slow polycyclic epidemics but may also affect the evolution of pathogen populations by diversifying the selection pressures exerted by their plant hosts at field scale. We compared the dynamics of natural populations of the fungal pathogen Zymoseptoria tritici in pure stands and in three binary mixtures of wheat cultivars (one susceptible cultivar and one cultivar carrying the recently broken-down Stb16q gene) over two annual field epidemics. We combined analyses of population ‘size’ based on disease severity, and of population ‘composition’ based on changes in the frequency of virulence against Stb16q in seedling assays with more than 3000 strains. Disease reductions were observed in mixtures late in the epidemic, at the whole canopy scale and on both cultivars, suggesting the existence of a reciprocal ‘protective’ effect. The three cultivar proportions in the mixtures (0.25, 0.5 and 0.75) modulated the decrease in (i) the size of the pathogen population relative to the two pure stands, (ii) the size of the virulent subpopulation, and (iii) the frequency of virulence relative to the pure stand of the cultivar carrying Stb16q . Our findings suggest that optimal proportions may differ slightly between the three indicators considered. We argued potential trade-offs that should be taken into account when deploying a resistance gene in cultivar mixtures: between the dual objectives ‘efficacy’ and ‘durability’, and between the ‘size’ and ‘frequency’ of the virulent subpopulation. Based on current knowledge, it remains unclear whether virulent subpopulation size or frequency has the largest influence on interepidemic virulence transmission.

Abstract Little is known about the impact of host immunity on sexual reproduction in fungal pathogens. In particular, it is unclear whether crossing requires both sexual partners to infect living plant tissues. We addressed this issue in a three-year experiment investigating different scenarios of Zymoseptoria tritici crosses on wheat according to the virulence (‘vir’) or avirulence (‘avr’) of the parents against a qualitative resistance gene. Co-inoculations (‘vir × vir’, ‘avr × vir’, ‘avr × avr’) and single inoculations were performed on a cultivar carrying the resistance gene (Cellule) and a susceptible cultivar (Apache), in the greenhouse. We assessed the intensity of asexual multiplication by scoring disease severity, and the intensity of sexual reproduction by counting the ascospores discharged from wheat residues. As expected, disease severity was more intense on Cellule for ‘vir × vir’ co-inoculations than for ‘avr × vir’ co-inoculations, with no disease for ‘avr × avr’. However, all types of co-inoculation yielded sexual offspring, whether or not the parental strains caused plant symptoms. Parenthood was confirmed by genotyping (SSR markers), and the occurrence of crosses between (co-)inoculated and exogenous strains (other strains from the experiment, or from far away) was determined. We found that symptomatic asexual infection was not required for a strain to participate in sexual reproduction, and that avirulent strains could be maintained asymptomatically “on” or “in” leaf tissues of plants carrying the corresponding resistant gene for long enough to reproduce sexually. In two of the three years, the intensity of sexual reproduction did not differ significantly between the three types of co-inoculation in Cellule, suggesting that crosses involving avirulent strains are not anecdotal. We discuss the possible mechanisms explaining the maintenance of avirulence in Z. tritici populations and supporting the potential efficacy of cultivar mixtures for limiting resistance gene breakdown. Highlights Avirulent Zymoseptoria tritici strains can reproduce sexually in wheat plants carrying the corresponding resistant gene. Symptomatic infection of plant tissues is not essential for a strain to reproduce sexually. Avirulent strains can be maintained asymptomatically “on” or “in” leaf tissues of plants carrying the corresponding resistant gene for long enough to reproduce sexually. Crosses of virulent strains with virulent and avirulent strains in a plant host carrying the corresponding resistance gene can produce offspring with similar population sizes. Several possible scenarios for sexual crosses can explain the maintenance of avirulence in Zymoseptoria tritici populations evolving in a wheat canopy, particular in cultivar mixtures.

Abstract Zymoseptoria tritici is the fungal pathogen responsible for Septoria tritici blotch on wheat. Disease outcome in this pathosystem is partly determined by isolate-specific resistance, where wheat resistance genes recognize specific fungal factors triggering an immune response. Despite the large number of known wheat resistance genes, fungal molecular determinants involved in such cultivar-specific resistance remain largely unknown. We identified the avirulence factor AvrStb9 using association mapping and functional validation approaches. Pathotyping AvrStb9 transgenic strains on Stb9 cultivars, near isogenic lines and wheat mapping populations, showed that AvrStb9 interacts with Stb9 resistance gene, triggering an immune response. AvrStb9 encodes an unusually large avirulence gene with a predicted secretion signal and a protease domain. It belongs to a S41 protease family conserved across different filamentous fungi in the Ascomycota class and may constitute a core effector. AvrStb9 is also conserved among a global Z. tritici population and carries multiple amino acid substitutions caused by strong positive diversifying selection. These results demonstrate the contribution of an ‘atypical’ conserved effector protein to fungal avirulence and the role of sequence diversification in the escape of host recognition, adding to our understanding of host-pathogen interactions and the evolutionary processes underlying pathogen adaptation. Author Summary Fungal avirulence ( Avr ) genes are involved in gene-for-gene relationships with host resistance genes. Avr genes may at the same time target host defenses to allow infection and be recognized by a host resistance gene triggering a defense response. The fungus Zymoseptoria tritici causes Septoria tritici blotch, a major disease of wheat worldwide. Z. tritici populations rapidly adapt to selection pressures such as host resistance, leading to resistance breakdown. We report the identification of the avirulence gene AvrStb9 based on genetic mapping, sequence polymorphisms and allele swapping. AvrStb9 is involved in the interaction with Stb9 resistance gene following the gene-for-gene model, and its recognition hinders disease symptoms in hosts carrying the corresponding resistance gene. Unlike other known Z. tritici Avr effectors, AvrStb9 encodes for an unusually large Avr protein with a predicted protease S41 domain conserved among diverse ascomycete lineages. We also highlight several gene mutations likely involved in escaping Stb9 -mediated recognition.

Foliar plant pathogens require liquid or vapour water for at least part of their development, but their response and adaptive tolerance to moisture conditions has been much less studied than other meteorological factors to date. Here, we examine the impact on the wheat- Zymoseptoria tritici interaction of altering optimal moisture conditions conducive to infection. We assessed the responses in planta of 48 Z. tritici strains collected in two climatologically distinct locations (Ireland and Israel) to four high moisture regimes differing in the duration of uninterrupted exposure to saturated relative humidity (100% RH) during the first three days of infection. Individual- and population-level moisture reaction norms expressing how the sporulating area of a lesion change with the RH conditions were established based on visual assessments of lesion development at 14, 17 and 20 days post-inoculation (dpi). Our findings highlighted: (i) a critical time-dependent effect on lesion development of interrupted periods of exposure to 100% RH during these earliest infection stages; (ii) a marked interindividual variation in the sensitivity to RH conditions both in terms of strain average moisture response and plasticity; (iii) a higher tolerance at 14 dpi of the Israeli population to interrupted periods of exposure to 100% RH. By indicating that sensitivity to sub-optimal moisture conditions may vary greatly between Z. tritici individuals and populations, this study provides the first evidence of moisture adaptation signature in a fungal plant pathogen. This suggests that understanding such variation will be critical to predict their response to changing climatic conditions.

This study provides empirical evidence for antagonistic density-dependence mechanisms driving sexual reproduction in the wheat fungal pathogen Zymoseptoria tritici. Biparental crosses with 12 increasing inoculum concentrations, in controlled conditions, showed that sexual reproduction in Z. tritici was impacted by an Allee effect due to mate limitation and a competition with asexual multiplication for resource allocation. The highest number of ascospores discharged was reached at intermediate inoculum concentrations (from 5.104 conidia.mL-1 to 106 conidia.mL-1). Consistent with these results for controlled co-inoculation, we found that the intensity of sexual reproduction varied with both cropping period and the vertical position of the host tissues in the field, with a maximum between 25 and 35 cm above the ground. An optimal lesion density (disease severity of 30 to 45%) maximizing offspring (ascospores) number was established, and its eco-evolutionary consequences are considered here. Two ecological mechanisms may be involved: competition for resources between the two modes of reproduction (decrease in the host resources available for sexual reproduction due to their prior use in asexual multiplication), and competitive disequilibrium between the two parental isolates, due to differential interaction dynamics with the host, for example, leading to an imbalance between mating types. A conceptual model based on these results suggest that sexual reproduction plays a key role in the evolution of pathogenicity traits, including virulence and aggressiveness. Ecological knowledge about the determinants of sexual reproduction in Z. tritici may, therefore, open up new perspectives for the management of other fungal foliar pathogens with dual modes of reproduction.

Abstract Crop pathogens pose severe risks to global food production due to the rapid rise of resistance to pesticides and host resistance breakdowns. Predicting future risks requires monitoring tools to identify changes in the genetic composition of pathogen populations. Here we report the design of a microfluidics-based amplicon sequencing assay to multiplex 798 loci targeting virulence and fungicide resistance genes, and randomly selected genome-wide markers for the fungal pathogen Zymoseptoria tritici . The fungus causes one of the most devastating diseases on wheat showing rapid adaptation to fungicides and host resistance. We optimized the primer design by integrating polymorphism data from 632 genomes of the same species. To test the performance of the assay, we genotyped 192 samples in two replicates. Analysis of the short-read sequence data generated by the assay showed a fairly stable success rate across samples to amplify a large number of loci. The performance was consistent between samples originating from pure genomic DNA as well as material extracted directly from infected wheat leaves. In samples with mixed genotypes, we found that the assay recovers variations in allele frequencies. We also explored the potential of the amplicon assay to recover transposable element insertion polymorphism relevant for fungicide resistance. As a proof-of-concept, we show that the assay recovers the pathogen population structure across French wheat fields. Genomic monitoring of crop pathogens contributes to more sustainable crop protection and yields.

This preprint has been reviewed and recommended by Peer Community In Evolutionary Biology (http://dx.doi.org/10.24072/pci.evolbiol.100039). The efficiency of plant resistance to fungal pathogen populations is expected to decrease over time, due to its evolution with an increase in the frequency of virulent or highly aggressive strains. This dynamics may differ depending on the scale investigated (annual or pluriannual), particularly for annual crop pathogens with both sexual and asexual reproduction cycles. We assessed this time-scale effect, by comparing aggressiveness changes in a local Zymoseptoria tritici population over an eight-month cropping season and a six-year period of wheat monoculture. We collected two pairs of subpopulations to represent the annual and pluriannual scales: from leaf lesions at the beginning and end of a single annual epidemic, and from crop debris at the beginning and end of a six-year period. We assessed two aggressiveness traits - latent period and lesion size - on sympatric and allopatric host varieties. A trend toward decreased latent period concomitant with a significant loss of variability was established during the course of the annual epidemic, but not over the six-year period. Furthermore, a significant cultivar effect (sympatric vs. allopatric) on the average aggressiveness of the isolates revealed host adaptation, arguing that the observed patterns could result from selection. We thus provide an experimental body of evidence of an epidemiological trade-off between the intra- and inter-annual scales in the evolution of aggressiveness in a local plant pathogen population. More aggressive isolates were collected from upper leaves, on which disease severity is usually lower than on the lower part of the plants left in the field as crop debris after harvest. We suggest that these isolates play little role in sexual reproduction, due to an Allee effect (difficulty finding mates at low pathogen densities), particularly as the upper parts of the plant are removed from the field, explaining the lack of transmission of increases in aggressiveness between epidemics.

Abstract Monitoring virulent strains within fungal pathogen populations is crucial to improve host resistance deployment strategies. Such monitoring increasingly involves field pathogenomics studies of molecular polymorphisms in genomes based on high-throughput screening technologies. However, it is not always straightforward to predict virulence phenotypes from these polymorphisms and in planta phenotyping remains necessary. We developed a method for ‘bulk phenotyping on checkerboard microcanopies of wheat near-isogenic lines’ (BPC) for estimating the frequency of virulence against an Stb gene in populations of Zymoseptoria tritici , the causal agent of Septoria tritici blotch in wheat, without the need for strain-by-strain phenotyping. Our method involves the uniform inoculation of a microcanopy of two wheat lines – one with the resistance gene and the other without it – with a multi-strain cocktail representative of the population to be characterized, followed by the differential quantification of infection points (lesions). Using Stb16q , a resistance gene that has recently broken down in Europe, we found a robust correlation between the ratio of the mean number of lesions on each wheat line and the frequency of virulent strains in the inoculum. Using pairs of virulent and avirulent strains, and synthetic populations consisting of 10 virulent strains and 10 avirulent strains mixed in different proportions, we validated the principle of the method and established standard curves at virulence frequencies close to those observed in natural conditions. We discuss the potential of this method for virulence monitoring in combination with recently developed molecular methods.