Prolonged single molecule imaging in live cells requires labels that do not aggregate, have high contrast, and are photo-stable. To address these requirements, we have generated arrays of modular protein domains that function as fluorophore recruitment platforms. ArrayG, a linear repeat of GFP-nanobodies, recruits free monomeric wild-type GFP, which brightens ~15-fold upon binding the array. The fluorogenic ArrayG tag effectively eliminates background fluorescence from free binders, a major impediment to high-throughput acquisition of long trajectories in recruitment based imaging strategies. The photo-stability of ArrayG and consistently low background allowed us to continuously track single integrins for as long as 105 seconds (2100 frames). Prolonged tracking of both kinesin and integrin revealed repeated state-switching events, a measurement capability that is crucial to a mechanistic understanding of complex cellular processes. We also report an orthogonal array tag, based on a DHFR-nanobody, for prolonged dual color imaging of single molecules.

Segmenting cell nuclei within microscopy images is a ubiquitous task in biological research and clinical applications. Unfortunately, segmenting low-contrast overlapping objects that may be tightly packed is a major bottleneck in standard deep learning-based models. We report a Nuclear Segmentation Tool (NuSeT) based on deep learning that accurately segments nuclei across multiple types of fluorescence imaging data. Using a hybrid network consisting of U-Net and Region Proposal Networks (RPN), followed by a watershed step, we have achieved superior performance in detecting and delineating nuclear boundaries in 2D and 3D images of varying complexities. By using foreground normalization and additional training on synthetic images containing non-cellular artifacts, NuSeT improves nuclear detection and reduces false positives. NuSeT addresses common challenges in nuclear segmentation such as variability in nuclear signal and shape, limited training sample size, and sample preparation artifacts. Compared to other segmentation models, NuSeT consistently fares better in generating accurate segmentation masks and assigning boundaries for touching nuclei.

Cellular processes take place over many timescales, prompting the development of precision measurement technologies that cover milliseconds to hours. Here we describe ArrayG, a bipartite fluorogenic system composed of a GFP-nanobody array and monomeric wtGFP binders. The free binders are initially dim but brighten 15 fold upon binding the array, suppressing background fluorescence. By balancing rates of intracellular binder production, photo-bleaching, and stochastic binder exchange on the array, we achieved temporally unlimited tracking of single molecules. Fast (20-180Hz) tracking of ArrayG tagged kinesins and integrins, for thousands of frames, revealed repeated state-switching and molecular heterogeneity. Slow (0.5 Hz) tracking of single histones for as long as 1 hour showed fractal dynamics of chromatin. We also report ArrayD, a DHFR-nanobody-array tag for dual color imaging. The arrays are aggregation resistant and combine high brightness, background suppression, fluorescence replenishment, and extended choice of fluorophores, opening new avenues for seeing and tracking single molecules in living cells.

Yes-associated protein 1 (YAP) is a transcriptional regulator with critical roles in mechanotransduction, organ size control, and regeneration. Here, using new tools for real-time visualization of native YAP and target gene transcription dynamics, we show that a cycle of fast exodus of nuclear YAP to the cytoplasm followed by fast reentry to the nucleus (“localization-resets”) activates YAP target genes. These “resets” could be induced by calcium signaling, modulation of actomyosin contractility, or mitosis. Using nascent-transcription reporter knock-ins of YAP target genes, we observed a strict association between these resets and downstream transcription. Oncogenically-transformed transformed cell lines lacked localization-resets and instead showed dramatically elevated rates of nucleocytoplasmic shuttling of YAP, suggesting an escape from compartmentalization-based control. The single-cell localization and transcription traces suggest that YAP activity is not a simple linear function of nuclear enrichment and point to a new model of transcriptional activation based on nucleocytoplasmic exchange properties of YAP.