ABSTRACT Dolosigranulum pigrum is positively associated with indicators of health in multiple epidemiological studies of human nasal microbiota. Knowledge of the basic biology of D. pigrum is a prerequisite for evaluating its potential for future therapeutic use; however, such data are very limited. To gain insight into D. pigrum ’s chromosomal structure, pangenome and genomic stability, we compared the genomes of 28 D. pigrum strains that were collected across 20 years. Phylogenomic analysis showed closely related strains circulating over this period and closure of 19 genomes revealed highly conserved chromosomal synteny. Gene clusters involved in the mobilome and in defense against mobile genetic elements (MGEs) were enriched in the accessory genome versus the core genome. A systematic analysis for MGEs identified the first candidate D. pigrum prophage and insertion sequence. A systematic analysis for genetic elements that limit the spread of MGEs, including restriction modification (RM), CRISPR-Cas, and deity-named defense systems, revealed strain-level diversity in host defense systems that localized to specific genomic sites including one RM system hotspot. Analysis of CRISPR spacers pointed to a wealth of MGEs against which D. pigrum defends itself. These results reveal a role for horizontal gene transfer and mobile genetic elements in strain diversification while highlighting that in D. pigrum this occurs within the context of a highly stable chromosomal organization protected by a variety of defense mechanisms. IMPORTANCE Dolosigranulum pigrum is a candidate beneficial bacterium with potential for future therapeutic use. This is based on its positive associations with characteristics of health in multiple studies of human nasal microbiota across the span of human life. For example, high levels of D. pigrum nasal colonization in adults predicts the absence of Staphylococcus aureus nasal colonization. Also, D. pigrum nasal colonization in young children is associated with healthy control groups in studies of middle ear infections. Our analysis of 28 genomes revealed a remarkable stability of D. pigrum strains colonizing people in the U.S. across a 20-year span. We subsequently identified factors that can influence this stability, including genomic stability, phage predators, the role of MGEs in strain-level variation and defenses against MGEs. Finally, these D. pigrum strains also lacked predicted virulence factors. Overall, these findings add additional support to the potential for D. pigrum as a therapeutic bacterium.

Background Multiple epidemiological studies identify Dolosigranulum pigrum as a candidate beneficial bacterium based on its positive association with health, including negative associations with nasal/nasopharyngeal colonization by the pathogenic species Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae .Results Using a multipronged approach to gain new insights into D. pigrum function, we observed phenotypic interactions and predictions of genomic capacity that support a role for microbe-microbe interactions involving D. pigrum in shaping the composition of human nasal microbiota. We identified in vivo community-level and in vitro phenotypic cooperation by specific nasal Corynebacterium species. Also, D. pigrum inhibited S. aureus growth in vitro . Whereas, robust inhibition of S. pneumoniae required both D. pigrum and a nasal Corynebacterium together, and not either alone. D. pigrum L-lactic-acid production was insufficient to account for these inhibitions. Genomic analysis of 11 strains revealed that D. pigrum has a small genome (average 1.86 Mb) and multiple predicted auxotrophies consistent with D. pigrum relying on its human host and cocolonizing bacteria for key nutrients. Further, the accessory genome of D. pigrum encoded a diverse repertoire of biosynthetic gene clusters, some of which may have a role in microbe-microbe interactions.Conclusions These new insights into D. pigrum ’s functions advance the field from compositional analysis to genomic and phenotypic experimentation on a potentially beneficial bacterial resident of the human upper respiratory tract and lay the foundation for future animal and clinical experiments.* List of abbreviations : ANCOM : Analysis of Composition of Microbiomes CFUs : Colony Forming Units CFCAM : Cell-Free Conditioned Agar Medium CFCM : Cell-Free Conditioned Medium BHI : Brain Heart Infusion BHIT : Brain Heart Infusion supplemented with Triolein BGC : Biosynthetic Gene Cluster

Cyclic peptides represent a burgeoning area of interest in therapeutic and biotechnological research. In opposition to their linear counterparts, cyclic peptides, such as certain ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs), are more conformationally constrained and less susceptible to proteolytic degradation. The lanthipeptide RiPP cytolysin L forms a covalently enforced helical structure that may be used to disrupt helical interactions at protein-protein interfaces. Herein, an expression system is reported to produce lanthipeptides and structurally diverse cytolysin L derivatives in mammalian cells. Successful targeting of lanthipeptides to the nucleus is demonstrated. In vivo expression and targeting of such peptides in mammalian cells may allow for screening of lanthipeptide inhibitors of native protein-protein interactions.

Cyclic peptides, such as most ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs), represent a burgeoning area of interest in therapeutic and biotechnological research because of their conformational constraints and reduced susceptibility to proteolytic degradation compared to their linear counterparts. Herein, an expression system is reported that enables the production of structurally diverse lanthipeptides and derivatives in mammalian cells. Successful targeting of lanthipeptides to the nucleus, the endoplasmic reticulum, and the plasma membrane is demonstrated. In vivo expression and targeting of such peptides in mammalian cells may allow for screening of lanthipeptide-based cyclic peptide inhibitors of native, organelle-specific protein–protein interactions in mammalian systems.