ABSTRACT The GTPase Rab1 is a master regulator of both the early secretory pathway and autophagy. Rab1 activation is controlled by its GEF (guanine nucleotide exchange factor), the multi-subunit TRAPPIII complex. The Trs85 regulatory subunit is critical for robust activation of Rab1 but its mechanistic role within the complex has remained unclear. Here we report the cryo-EM structure of the intact yeast TRAPPIII complex bound to its substrate Rab1/Ypt1. The orientation of the Rab1/Ypt1 hypervariable domain when bound to the complex leads to a model for how TRAPPIII associates with and activates Rab1/Ypt1 at the membrane surface. We identify a conserved amphipathic α-helix motif within Trs85 and demonstrate that this helix is required for stable membrane binding and Rab1/Ypt1 activation by TRAPPIII. Taken together, our results provide a comprehensive analysis of the structure and function of the yeast TRAPPIII complex and reveal that the key function of Trs85 is to serve as a membrane anchor, via its amphipathic helix, for the entire TRAPPIII complex.

Abstract The DNA mismatch repair (MMR) factor Mlh1-Pms1 contains long intrinsically disordered regions (IDRs). While essential for MMR, their exact functions remain elusive. We performed cross-linking mass spectrometry to identify the major interactions within the Mlh1-Pms1 heterodimer and used this information to insert FRB and FKBP dimerization domains into the IDRs of Mlh1 and Pms1. Yeast bearing these constructs were grown with rapamycin to induce dimerization. Strains containing FRB and FKBP domains in the Mlh1 IDR displayed complete MMR defects when grown with rapamycin, but removing rapamycin restored MMR functions. Furthermore, linking the Mlh1 and Pms1 IDRs through FRB-FKBP dimerization disrupted Mlh1-Pms1 binding to DNA, inappropriately activated Mlh1-Pms1, and caused MMR defects in vivo . We conclude that dynamic and coordinated rearrangements of the MLH IDRs regulate how the complex clamps DNA to catalyze MMR. The application of the FRB-FKBP dimerization system to interrogate in vivo functions of a critical repair complex will be useful for probing IDRs in diverse enzymes and to probe transient loss of MMR on demand.

Phosphorylation is one of the most dynamic and widespread post-translational modifications regulating virtually every aspect of eukaryotic cell biology. Here we present a comprehensive phosphoproteomic dataset for budding yeast, comprised of over 30,000 high confidence phosphorylation sites identified by mass spectrometry. This single dataset nearly doubles the size of the known phosphoproteome in budding yeast and defines a set of cell cycle-regulated phosphorylation events. With the goal of enhancing the identification of functional phosphorylation events, we performed computational positioning of phosphorylation sites on available 3D protein structures and systematically identified events predicted to regulate protein complex architecture. Results reveal a large number of phosphorylation sites mapping to or near protein interaction interfaces, many of which result in steric or electrostatic clashes predicted to disrupt the interaction. Phosphorylation site mutants experimentally validate our predictions and support a role for phosphorylation in negatively regulating protein-protein interactions. With the advancement of Cryo-EM and the increasing number of available structures, our approach should help drive the functional and spatial exploration of the phosphoproteome.

Recent, rapid advances in cross-linking mass spectrometry (XL-MS) has enabled detection of novel protein-protein interactions and their structural dynamics at the proteome scale. Given the importance and scale of the novel interactions identified in these proteome-wide XL-MS studies, thorough quality assessment is critical. Almost all current XL-MS studies validate cross-links against known 3D structures of representative protein complexes. However, current structure validation approach only includes cross-links where both peptides mapped to the 3D structures. Here we provide theoretical and experimental evidence demonstrating this approach can drastically underestimate error rates for proteome-wide XL-MS datasets. Addressing current shortcomings, we propose and demonstrate a comprehensive set of four metrics, including orthogonal experimental validation to thoroughly assess quality of proteome-wide XL-MS datasets.

Protein-protein interactions play a vital role in nearly all cellular functions. Hence, understanding their interaction patterns and three-dimensional structural conformations can provide crucial insights about various biological processes and underlying molecular mechanisms for many disease phenotypes. Cross-linking mass spectrometry has the unique capability to detect protein-protein interactions at a large scale along with spatial constraints between interaction partners. However, the current cross-link search algorithms follow an MS2-centric approach and, as a result, suffer from a high rate of mis-identified cross-links (~15%). We address this urgent problem, by designing a novel MS3-centric approach for cross-link identification and implemented it as a search engine called MaXLinker. MaXLinker significantly outperforms the current state of the art search engine with up to 18-fold lower false positive rate. Additionally, MaXLinker results in up to 31% more cross-links, demonstrating its superior sensitivity and specificity. Moreover, we performed proteome-wide cross-linking mass spectrometry using K562 cells. Employing MaXLinker, we unveiled the most comprehensive set of 9,319 unique cross-links at 1% false discovery rate, comprising 8,051 intraprotein and 1,268 interprotein cross-links. Finally, we experimentally validated the quality of a large number of novel interactions identified in our study, providing a conclusive evidence for the robust performance of MaXLinker.