Summary Switch-like cyclin-dependent kinase (CDK)-1 activation is thought to underlie the abruptness of mitotic onset, but how CDKs can simultaneously phosphorylate many diverse substrates is unknown, and direct evidence for such phosphorylation dynamics in vivo is lacking. Here, we analysed protein phosphorylation states in single Xenopus embryos throughout synchronous cell cycles. Over a thousand phosphosites were dynamic in vivo , and assignment of cell cycle phases using egg extracts revealed hundreds of S-phase phosphorylations. Targeted phosphoproteomics in single embryos showed switch-like mitotic phosphorylation of diverse protein complexes. The majority of cell cycle-regulated phosphosites occurred in CDK consensus motifs, and 72% located to intrinsically disordered regions. Dynamically phosphorylated proteins, and documented substrates of cell cycle kinases, are significantly more disordered than phosphoproteins in general. Furthermore, 30-50% are components of membraneless organelles. Our results suggest that phosphorylation of intrinsically disordered proteins by cell cycle kinases, particularly CDKs, allows switch-like mitotic cellular reorganisation.

ABSTRACT Recent studies have shown that the cell proliferation antigen Ki-67 is not required for cell proliferation. Here, we demonstrate that Ki-67 enables implementation of transcriptional programmes conferring cellular plasticity, and is required for each step of tumour initiation, growth and metastasis. Ki-67 knockout causes global transcriptome remodelling, which, in mammary carcinoma cells, inhibits the epithelial-mesenchymal transition in a polycomb-repressive complex 2-dependent manner. This results in suppression of stem cell characteristics and sensitisation to various drug classes. Cancer cells lacking Ki-67 proliferate normally in vivo , but tumour growth is inhibited due to disrupted angiogenesis, and metastasis is abrogated. Finally, mice lacking Ki-67 are resistant to chemical or genetic induction of intestinal tumourigenesis. Thus, Ki-67, which is expressed in all proliferating cancer cells, confers the plasticity required for different steps of carcinogenesis.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer with high mortality. The limited therapeutic options for advanced disease include treatment with Sorafenib, a multi-kinase inhibitor whose targets include the Mediator kinase CDK8. Since CDK8 has reported oncogenic activity in Wnt-dependent colorectal cancer, we investigated whether it is also involved in HCC. We find that CDK8 and its paralogue CDK19 are significantly overexpressed in HCC patients, where high levels correlate with poor prognosis. Liver-specific genetic deletion of CDK8 in mice is well supported and protects against chemical carcinogenesis. Deletion of either CDK8 or CDK19 in hepatic precursors had little effect on gene expression in exponential cell growth but prevented oncogene-induced transformation. This phenotype was reversed by concomitant deletion of TP53. These data support important and non-redundant roles for mediator kinases in liver carcinogenesis, where they genetically interact with the TP53 tumor suppressor.

Abstract CDK8 and CDK19 form a conserved cyclin-dependent kinase subfamily that interacts with the essential transcription complex, Mediator, and also promotes transcription by phosphorylating the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. Cells lacking either CDK8 or CDK19 are viable and have limited transcriptional alterations, but whether the two kinases redundantly control cell differentiation is unknown. Here, we find that CDK8 is dispensable for RNA polII CTD phosphorylation, regulation of gene expression, normal intestinal homeostasis and efficient tumourigenesis in mice. Furthermore, CDK8 is largely redundant with CDK19 in the control of gene expression. Yet, while their combined deletion in intestinal organoids reduces long-term proliferative capacity, it is not lethal and allows differentiation. Nevertheless, in double mutant organoids, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) pathway is transcriptionally and functionally downregulated, leading to mucus accumulation and increased secretion by goblet cells. This phenotype can be recapitulated by pharmacological inhibition of CDK8/19 kinase activity. Thus, the Mediator kinases are not essential for cell proliferation and differentiation, but they cooperate to regulate tissue-specific transcriptional programmes.