ABSTRACT Adeno-associated viral (AAV) vectors have demonstrated great utility for long-term gene expression in muscle tissue. However, the mechanisms by which recombinant AAV (rAAV) genomes persist in muscle tissue remain unclear. Using a recombinant shuttle vector, we have demonstrated that circularized rAAV intermediates impart episomal persistence to rAAV genomes in muscle tissue. The majority of circular intermediates had a consistent head-to-tail configuration consisting of monomer genomes which slowly converted to large multimers of >12 kbp by 80 days postinfection. Importantly, long-term transgene expression was associated with prolonged (80-day) episomal persistence of these circular intermediates. Structural features of these circular intermediates responsible for increased persistence included a DNA element encompassing two viral inverted terminal repeats (ITRs) in a head-to-tail orientation, which confers a 10-fold increase in the stability of DNA following incorporation into plasmid-based vectors and transfection into HeLa cells. These studies suggest that certain structural characteristics of AAV circular intermediates may explain long-term episomal persistence with this vector. Such information may also aid in the development of nonviral gene delivery systems with increased efficiency.

Sarcolemma-associated neuronal NOS (nNOS) plays a critical role in normal muscle physiology. In Duchenne muscular dystrophy (DMD), the loss of sarcolemmal nNOS leads to functional ischemia and muscle damage; however, the mechanism of nNOS subcellular localization remains incompletely understood. According to the prevailing model, nNOS is recruited to the sarcolemma by syntrophin, and in DMD this localization is altered. Intriguingly, the presence of syntrophin on the membrane does not always restore sarcolemmal nNOS. Thus, we wished to determine whether dystrophin functions in subcellular localization of nNOS and which regions may be necessary. Using in vivo transfection of dystrophin deletion constructs, we show that sarcolemmal targeting of nNOS was dependent on the spectrin-like repeats 16 and 17 (R16/17) within the rod domain. Treatment of mdx mice (a DMD model) with R16/17-containing synthetic dystrophin genes effectively ameliorated histological muscle pathology and improved muscle strength as well as exercise performance. Furthermore, sarcolemma-targeted nNOS attenuated α-adrenergic vasoconstriction in contracting muscle and improved muscle perfusion during exercise as measured by Doppler and microsphere circulation. In summary, we have identified the dystrophin spectrin-like repeats 16 and 17 as a novel scaffold for nNOS sarcolemmal targeting. These data suggest that muscular dystrophy gene therapies based on R16/17-containing dystrophins may yield better clinical outcomes than the current therapies.

Diastolic dysfunction is a prominent feature of cardiac aging in both mice and humans. We show here that 8-week treatment of old mice with the mitochondrial targeted peptide SS-31 (elamipretide) can substantially reverse this deficit. SS-31 normalized the increase in proton leak and reduced mitochondrial ROS in cardiomyocytes from old mice, accompanied by reduced protein oxidation and a shift towards a more reduced protein thiol redox state in old hearts. Improved diastolic function was concordant with increased phosphorylation of cMyBP-C Ser282 but was independent of titin isoform shift. Late-life viral expression of mitochondrial-targeted catalase (mCAT) produced similar functional benefits in old mice and SS-31 did not improve cardiac function of old mCAT mice, implicating normalizing mitochondrial oxidative stress as an overlapping mechanism. These results demonstrate that pre-existing cardiac aging phenotypes can be reversed by targeting mitochondrial dysfunction and implicate mitochondrial energetics and redox signaling as therapeutic targets for cardiac aging.

ABSTRACT Background Adeno‐associated virus (AAV) 8 and 9 are in clinical trials for treating neuromuscular diseases such as Duchenne muscular dystrophy (DMD). Muscle consists of myofibres of different types and sizes. However, little is known about the fibre type and fibre size tropism of AAV in large mammals. Methods We evaluated fibre type‐ and size‐specific transduction properties of AAV8 and AAV9 in 17 dogs that received systemic gene transfer (dose 1.94 ± 0.52 × 10 14 vg/kg; injected at 2.86 ± 0.30 months; harvested at 20.79 ± 3.30 months). For AAV8, two DMD dogs and three carrier dogs received an alkaline phosphatase (AP) reporter vector, and five DMD dogs received a four‐repeat microdystrophin (uDys) vector. For AAV9, one normal and one DMD dog received the AP vector, and five DMD dogs received a five‐repeat uDys vector. Association between AAV transduction and the fibre type/size was studied in three muscles that showed mosaic transgene expression, including the biceps femoris, teres major and latissimus dorsi. Results Transgene expression was detected in 30%–45% of myofibres. In the AP reporter vector–injected dogs, neither AAV8 nor AAV9 showed a statistically significant fibre type preference. Interestingly, AP expression was enriched in smaller fibres. In uDys‐treated DMD dogs, slow and fast myofibres were equally transduced. Notably, uDys‐expressing myofibres were significantly larger than uDys‐negative myofibres irrespective of the AAV serotype ( p < 0.0001). In AAV8 uDys vector–injected dogs, the mini‐Feret diameter was 15%, 16% and 23% larger in uDys‐positive slow, fast and hybrid fibres, respectively; the cross‐sectional area was 30%, 34% and 46% larger in uDys‐positive slow, fast and hybrid fibres, respectively. In AAV9 uDys vector–injected dogs, the mini‐Feret diameter was 12%, 13% and 25% larger in uDys‐positive slow, fast and hybrid fibres, respectively; the cross‐sectional area was 25%, 28% and 59% larger in uDys‐positive slow, fast and hybrid fibres, respectively. Conclusions Our studies suggest that AAV8 and AAV9 transduce fast and slow myofibres at equivalent efficiency. Importantly, uDys therapy effectively prevented dystrophic myofibre atrophy. Our study provides important insight into systemic muscle AAV delivery in large mammals and supports further development of uDys gene therapy for DMD.