S ummary Retinal ON starburst amacrine cells (SACs) play a critical role in computing stimulus direction, partly in service of image stabilization by optokinetic nystagmus. ON SAC responses are sculpted by rich GABAergic innervation, mostly from neighbouring SACs. Surprisingly, however, we find that glycinergic narrow field amacrine cells (NACs) serve as their dominant source of inhibition during sustained activity. Although NAC inputs constitute only ∼5% of inhibitory synapses to ON SACs, their distinct input patterns enable them to drive glycine inhibition during the both light increments and decrements. NAC-to-ON-SAC inhibition appears to be mediated by ultra-slow non-canonical glycine receptors containing the α4 subunit, which effectively summate during repetitive stimulation. Glycinergic inhibition strongly decreases the output gain of the SACs, ensuring that their direction-selective output is maintained over their operating range. These results reveal an unexpected role for glycinergic pathways and receptor kinetics in modulating direction selectivity in the retina.

Acetylcholine (ACh) is a key neurotransmitter that plays diverse roles in many parts of the central nervous system, including the retina. However, assessing the precise spatiotemporal dynamics of ACh is technically challenging and whether ACh transmits signals via rapid, point-to-point synaptic mechanisms, or broader-scale 'non-synaptic' mechanisms has been difficult to ascertain. Here, we examined the properties of cholinergic transmission at individual contacts made between direction-selective starburst amacrine cells and downstream ganglion cells in the retina. Using a combination of electrophysiology, serial block-face electron microscopy, and two-photon ACh imaging, we demonstrate that ACh signaling bears the hallmarks of both non-synaptic and synaptic forms of transmission. ACh co-activates nicotinic ACh receptors located on the intersecting dendrites of pairs of ganglion cells, with equal efficiency (non-synaptic)--and yet retains the ability to generate rapid 'miniature' currents (~1 ms rise times: synaptic). Fast cholinergic signals do not appear to depend on anatomically well-defined synaptic structures. We estimate that ACh spread is limited to ~1-2 μm from its sites of release, which may help starbursts drive local direction-selective cholinergic responses in ganglion cell dendrites. Together, our results establish the functional architecture for cholinergic signaling at a central synapse and propose a novel motif whereby single presynaptic sites can co-transmit information to multiple neurons on a millisecond timescale.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Recent studies indicate that the precise timing and location of excitation and inhibition (E/I) within active dendritic trees can significantly impact neuronal function. How excitatory and inhibitory inputs are functionally organized at the subcellular level in intact circuits remains unclear. To address this issue, we took advantage of the retinal direction-selective ganglion cell circuit, in which directionally tuned inhibitory GABAergic input arising from starburst amacrine cells shape direction-selective dendritic responses. We combined two-photon Ca2+ imaging with genetic, pharmacological, and single-cell ablation methods to examine local E/I. We demonstrate that when active dendritic conductances are blocked, direction selectivity emerges semi-independently within unusually small dendritic segments (<10 µm). Impressively, the direction encoded by each segment is relatively homogenous throughout the ganglion cell’s dendritic tree. Together the results demonstrate a precise subcellular functional organization of excitatory and inhibitory input, which suggests that the parallel processing scheme proposed for direction encoding could be more fine-grained than previously envisioned.

In the mammalian retina, asymmetric inhibitory signals arising from the direction-selective dendrites of GABAergic/cholinergic starburst amacrine cells are thought to be crucial for originating direction selectivity. Contrary to this notion, however, we found that direction selectivity in downstream ganglion cells remains remarkably unaffected when starburst output is rendered non-directional (using a novel strategy combining a conditional GABA receptor knockout mouse with optogenetics). We show that temporal asymmetries between excitation/inhibition, arising from the differential connectivity patterns of starburst cholinergic and GABAergic synapses to ganglion cells, form the basis for a parallel mechanism generating direction selectivity. We further demonstrate that these distinct mechanisms work in a coordinated way to refine direction selectivity as the stimulus crosses the ganglion cells receptive field. Thus, precise spatiotemporal patterns of inhibition and excitation that shape directional responses in ganglion cells are shaped by two core mechanisms, both arising from distinct specializations of the starburst network.