Summary Ion-driven motors are rare in biology. The archetypes of the three classes identified to date are ATP synthase, the bacterial flagellar motor, and a proton-driven motor that powers gliding motility and protein secretion in Bacteroidetes bacteria. Whilst the molecular mechanism of ATP synthase is now well understood, structural information is lacking for the other two classes of motor. Here we present the structure of the Bacteroidetes gliding motility motor determined by cryo-electron microscopy. The motor is an asymmetric inner membrane protein complex in which the single transmembrane helices of two periplasm-spanning GldM proteins are positioned within a ring of five GldL proteins. Combining mutagenesis and single-molecule tracking, we identify protonatable amino acid residues within the transmembrane domain of the complex that are important for motor function. Our data imply a mechanism in which proton flow leads the periplasm-spanning GldM dimer to rotate with respect to the intra-membrane GldL ring to drive processes at the bacterial outer membrane. This work provides a molecular basis for understanding how the gliding motility motor is able to transduce the energy of the inner membrane protonmotive force across the bacterial cell envelope.

How complex, multi-component macromolecular machines evolved remains poorly understood. Here we reveal the evolutionary origins of the chemosensory machinery that controls flagellar motility in Escherichia coli . We first identified ancestral forms still present in Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Shewanella oneidensis and Methylomicrobium alcaliphilum , characterizing their structures by electron cryotomography and finding evidence that they function in a stress response pathway. Using bioinformatics, we then traced the evolution of the system through γ-Proteobacteria, pinpointing key evolutionary events that led to the machine now seen in E. coli. Our results suggest that two ancient chemosensory systems with different inputs and outputs (F6 and F7) existed contemporaneously, with one (F7) ultimately taking over the inputs and outputs of the other (F6), which was subsequently lost.

The bacterial flagellar motor is a cell-envelope-embedded macromolecular machine that functions as a propeller to move the cell. Rather than being an invariant machine, the flagellar motor exhibits significant variability between species, allowing bacteria to adapt to, and thrive in, a wide range of environments. For instance, different torque- generating stator modules allow motors to operate in conditions with different pH and sodium concentrations and some motors are adapted to drive motility in high-viscosity environments. How such diversity evolved is unknown. Here we use electron cryo-tomography to determine the in situ macromolecular structures of the flagellar motors of three Gammaproteobacteria species: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, and Shewanella oneidensis MR-1, providing the first views of intact motors with dual stator systems. Complementing our imaging with bioinformatics analysis, we find a correlation between the stator system of the motor and its structural complexity. Motors with a single H+-driven stator system have only the core P- and L-rings in their periplasm; those with dual H+-driven stator systems have an extra component elaborating their P-ring; and motors with Na+- (or dual Na+-H+)- driven stator systems have additional rings surrounding both their P- and L-rings. Our results suggest an evolution of structural complexity that may have enabled pathogenic bacteria like L. pneumophila and P. aeruginosa to colonize higher-viscosity environments in animal hosts.

Archaeal swimming motility is driven by rotary motors called archaella. The structure of these motors, and particularly how they are anchored in the absence of a peptidoglycan cell wall, is unknown. Here, we use electron cryotomography to visualize the archaellar motor in vivo in Thermococcus kodakaraensis. Compared to the homologous bacterial type IV pilus (T4P), we observe structural similarities as well as several unique features. While the position of the cytoplasmic ATPase appears conserved, it is not braced by linkages that extend upward through the cell envelope as in the T4P, but rather by cytoplasmic components that attach it to a large conical frustum up to 500 nm in diameter at its base. In addition to anchoring the lophotrichous bundle of archaella, the conical frustum associates with chemosensory arrays and ribosome-excluding material and may function as a polar organizing center for the coccoid cells.

Abstract The SARS-CoV2 Omicron variant sub-lineages spread rapidly through the world, mostly due to their immune-evasive properties. This has put a significant part of the population at risk for severe disease and underscores the need for anti-SARS-CoV-2 agents that are effective against emergent strains in vulnerable patients. Camelid nanobodies are attractive therapeutic candidates due to their high stability, ease of large-scale production and potential for delivery via inhalation. Here, we characterize the RBD-specific nanobody W25, which we previously isolated from an alpaca, and show superior neutralization activity towards Omicron lineage BA.1 in comparison to all other SARS-CoV2 variants. Structure analysis of W25 in complex with the SARS-CoV2 spike surface glycoprotein shows that W25 engages an RBD epitope not covered by any of the antibodies previously approved for emergency use. Furthermore, we show that W25 also binds the spike protein from the emerging, more infectious Omicron BA.2 lineage with picomolar affinity. In vivo evaluation of W25 prophylactic and therapeutic treatments across multiple SARS-CoV-2 variant infection models, together with W25 biodistribution analysis in mice, demonstrates favorable pre-clinical properties. Together, these data endorse prioritization of W25 for further clinical development.