Abstract Convergent trait evolution is a recurrent phenomenon in all domains of the tree of life. While some convergent traits are caused by simple sequence changes, many are associated with extensive changes to the sequence and regulation of large cohorts of genes. It is unknown how organisms traverse this expansive genotype space to assemble such complex convergent phenotypes. C 4 photosynthesis is a paradigm of large-scale phenotypic convergence. Conceptual and mathematical models propose that C 4 photosynthesis evolved from ancestral C 3 photosynthesis through sequential adaptive changes. These adaptive changes could have been rapidly assembled if modifications to the activity and abundance of enzymes of the C 4 cycle was neutral in C 3 plants. This neutrality would enable populations of C 3 plants to maintain genotypes with expression levels of C 4 enzymes analogous to those in C 4 species and thus enable rapid assembly of a functional C 4 cycle from naturally occurring genotypes given shared environmental selection. Here we show that there is substantial natural variation in expression of genes encoding C 4 cycle enzymes between natural accessions of the C 3 plant Arabidopsis thaliana . We further show through targeted transgenic experiments in the C 3 crop Oryza sativa , that high expression of the majority of C 4 cycle enzymes in rice is neutral with respect to growth, development, biomass and photosynthesis. Thus, substantial variation in the abundance and activity of C 4 cycle enzymes is permissible within the limits of operation of C 3 photosynthesis and the emergence of component parts of this complex convergent trait can be facilitated by neutral variation.

The chloroplastic oxaloacetate/malate transporter (OMT1 or DiT1) takes part in the malate valve that protects chloroplasts from excessive redox poise through export of malate and import of oxaloacetate (OAA). Together with the glutamate/malate transporter (DCT1 or DiT2), it connects carbon with nitrogen assimilation, by providing α-ketoglutarate for the GS/GOGAT reaction and exporting glutamate to the cytoplasm. OMT1 further plays a prominent role in C4 photosynthesis. OAA resulting from PEP-carboxylation is imported into the chloroplast, reduced to malate by plastidic NADP-MDH, and then exported for transport to bundle sheath cells. Both transport steps are catalyzed by OMT1, at the rate of net carbon assimilation. Therefore, to engineer C4 photosynthesis into C3 crops, OMT1 must be expressed in high amounts on top of core C4 metabolic enzymes. We report here high-level expression of ZmOMT1 from maize in rice (Oryza sativa ssp. indica IR64). Increased activity of the transporter in transgenic rice was confirmed by reconstitution of transporter activity into proteoliposomes. Unexpectedly, over-expression of ZmOMT1 in rice negatively affected growth, CO2 assimilation rate, total free amino acid contents, TCA cycle metabolites, as well as sucrose and starch contents. Accumulation of high amounts of aspartate and the impaired growth phenotype of OMT1 rice lines could be suppressed by simultaneous over-expression of ZmDiT2. Implications for engineering C4-rice are discussed.

Abstract Introduction of a C 4 photosynthetic pathway into C 3 rice ( Oryza sativa ) requires installation of a biochemical pump that concentrates CO 2 at the site of carboxylation in modified bundle sheath cells. To investigate the feasibility of this, we generated a quadruple line that simultaneously expresses four of the core C 4 photosynthetic enzymes from the NADP-malic enzyme subtype, phospho enol pyruvate carboxylase ( Zm PEPC), NADP-malate dehydrogenase ( Zm NADP-MDH), NADP-malic enzyme ( Zm NADP-ME) and pyruvate phosphate dikinase ( Zm PPDK), in a cell-specific manner. This led to enhanced enzyme activity but was largely neutral in its effects on photosynthetic rate and growth. Measurements of the flux of 13 CO 2 through photosynthetic metabolism revealed a significant increase in the incorporation of 13 C into malate, consistent with increased fixation of 13 CO 2 via PEP carboxylase in lines expressing the maize PEPC enzyme. We also showed 13 C labelling of aspartate indicating additional 13 CO 2 fixation into oxaloacetate by PEPC and conversion to aspartate by the endogenous aspartate aminotransferase activity. However, there were no significant differences in labelling of 3-phosphoglycerate (3PGA) or phospho enol pyruvate (PEP) indicating limited carbon flux through C 4 enzymes into the Calvin-Benson cycle. Crossing the quadruple line with a line with reduced glycine decarboxylase H-protein ( Os GDCH) abundance led to a photosynthetic phenotype characteristic of the reduced Os GDCH line and higher labelling of malate, aspartate and citrate. While Kranz anatomy or other anatomical modifications have not yet been installed in these plants to enable a fully functional C 4 cycle, these results demonstrate for the first-time flux through the carboxylation phase of C 4 metabolism in transgenic rice containing the key metabolic steps in the C 4 pathway.