Proline is an important component of salt‐stress responses of plants. In this study the role of proline as part of salt‐stress signalling in the desert plant Pancratium maritimum L. was examined. The data showed that salt‐stress brought about a reduction of the growth and protein content, particularly at 300 mM NaCl, that was significantly increased by exogenous proline. In the leaves, salt‐stress up‐regulated ubiquitin, a small protein targeting damaged proteins for degradation via the proteasome, up to 5‐fold as detected by western blotting. This change was also affected by proline even in non‐stressed leaves. However, salt‐stress resulted in a decrease in the amount of ubiquitin‐conjugates, particularly in the roots, and this effect was reversed by exogenous proline. Severe salt‐stress resulted in an inhibition of the antioxidative enzymes catalase and peroxidase as revealed by spectrophotometric assays and activity gels, but the activity of these enzymes was also maintained significantly higher in the presence of proline. Salt‐stress also up‐regulated several dehydrin proteins, analysed by western blotting, even in non‐stressed plants. It is concluded that proline improves the salt‐tolerance of Pancratium maritimum L. by protecting the protein turnover machinery against stress‐damage and up‐regulating stress protective proteins.

Most plants are known as C3 plants because the first product of photosynthetic CO2 fixation is a three-carbon compound1. C4 plants, which use an alternative pathway in which the first product is a four-carbon compound, have evolved independently many times and are found in at least 18 families2,3. In addition to differences in their biochemistry, photosynthetic organs of C4 plants show alterations in their anatomy and ultrastructure4. Little is known about whether the biochemical or anatomical characteristics of C4 photosynthesis evolved first. Here we report that tobacco, a typical C3 plant, shows characteristics of C4 photosynthesis in cells of stems and petioles that surround the xylem and phloem, and that these cells are supplied with carbon for photosynthesis from the vascular system and not from stomata. These photosynthetic cells possess high activities of enzymes characteristic of C4 photosynthesis, which allow the decarboxylation of four-carbon organic acids from the xylem and phloem, thus releasing CO2 for photosynthesis. These biochemical characteristics of C4 photosynthesis in cells around the vascular bundles of stems of C3 plants might explain why C4 photosynthesis has evolved independently many times.

Summary Much of humanity relies on rice ( Oryza sativa ) as a food source, but cultivation is water intensive and the crop is vulnerable to drought and high temperatures. Under climate change, periods of reduced water availability and high temperature are expected to become more frequent, leading to detrimental effects on rice yields. We engineered the high‐yielding rice cultivar ‘ IR 64’ to produce fewer stomata by manipulating the level of a developmental signal. We overexpressed the rice epidermal patterning factor Os EPF 1 , creating plants with substantially reduced stomatal density and correspondingly low stomatal conductance. Low stomatal density rice lines were more able to conserve water, using c . 60% of the normal amount between weeks 4 and 5 post germination. When grown at elevated atmospheric CO 2 , rice plants with low stomatal density were able to maintain their stomatal conductance and survive drought and high temperature (40°C) for longer than control plants. Low stomatal density rice gave equivalent or even improved yields, despite a reduced rate of photosynthesis in some conditions. Rice plants with fewer stomata are drought tolerant and more conservative in their water use, and they should perform better in the future when climate change is expected to threaten food security.

Another "green revolution" is needed for crop yields to meet demands for food. The international C(4) Rice Consortium is working toward introducing a higher-capacity photosynthetic mechanism--the C(4) pathway--into rice to increase yield. The goal is to identify the genes necessary to install C(4) photosynthesis in rice through different approaches, including genomic and transcriptional sequence comparisons and mutant screening.

Inventors in the field of mechanical and electronic engineering can access multitudes of components and, thanks to standardization, parts from different manufacturers can be used in combination with each other. The introduction of BioBrick standards for the assembly of characterized DNA sequences was a landmark in microbial engineering, shaping the field of synthetic biology. Here, we describe a standard for Type IIS restriction endonuclease-mediated assembly, defining a common syntax of 12 fusion sites to enable the facile assembly of eukaryotic transcriptional units. This standard has been developed and agreed by representatives and leaders of the international plant science and synthetic biology communities, including inventors, developers and adopters of Type IIS cloning methods. Our vision is of an extensive catalogue of standardized, characterized DNA parts that will accelerate plant bioengineering.

Abstract Convergent trait evolution is a recurrent phenomenon in all domains of the tree of life. While some convergent traits are caused by simple sequence changes, many are associated with extensive changes to the sequence and regulation of large cohorts of genes. It is unknown how organisms traverse this expansive genotype space to assemble such complex convergent phenotypes. C 4 photosynthesis is a paradigm of large-scale phenotypic convergence. Conceptual and mathematical models propose that C 4 photosynthesis evolved from ancestral C 3 photosynthesis through sequential adaptive changes. These adaptive changes could have been rapidly assembled if modifications to the activity and abundance of enzymes of the C 4 cycle was neutral in C 3 plants. This neutrality would enable populations of C 3 plants to maintain genotypes with expression levels of C 4 enzymes analogous to those in C 4 species and thus enable rapid assembly of a functional C 4 cycle from naturally occurring genotypes given shared environmental selection. Here we show that there is substantial natural variation in expression of genes encoding C 4 cycle enzymes between natural accessions of the C 3 plant Arabidopsis thaliana . We further show through targeted transgenic experiments in the C 3 crop Oryza sativa , that high expression of the majority of C 4 cycle enzymes in rice is neutral with respect to growth, development, biomass and photosynthesis. Thus, substantial variation in the abundance and activity of C 4 cycle enzymes is permissible within the limits of operation of C 3 photosynthesis and the emergence of component parts of this complex convergent trait can be facilitated by neutral variation.

ABSTRACT C 3 and C 4 grasses directly and indirectly provide the vast majority of calories to the human diet, yet our understanding of the molecular mechanisms driving photosynthetic productivity in grasses is largely unexplored. Here we define a genetic circuit comprised of SHR, IDD and PIN family members that specify vascular identify and ground cell proliferation in leaves of both C 3 and C 4 grasses. Ectopic expression and loss-of-function mutant studies of SHORT ROOT ( SHR ) paralogs in C 3 Oryza sativa (rice) and C 4 Setaria viridis (green millet) revealed a role in both minor vein formation and ground cell differentiation. Genetic and in vitro studies further suggest that SHR regulates this process through its interaction with Indeterminate Domain (IDD) IDD 12 and 13. We further show a direct interaction of these IDD proteins with a putative regulatory element within the auxin transporter PIN5c gene. Collectively, these studies indicated that a SHR-IDD regulatory circuit mediates auxin flow through the negative regulation of PIN protein expression to modulate minor vein patterning in the grasses.

Abstract We generated antisense constructs targeting two of the five Rubisco small subunit genes ( OsRBCS2 and 4 ) which account for between 30-40% of the RBCS transcript abundance in leaf blades. The constructs were driven by a maize phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) promoter known to have enriched expression in mesophyll cells (MCs). In the resulting lines leaf Rubisco protein content was reduced by between 30-50% and CO 2 assimilation rate was limited under photorespiratory and non-photorespiratory conditions. A relationship between Rubisco protein content and CO 2 assimilation rate was found. This was associated with a significant reduction in dry biomass accumulation and grain yield of between 37 to 70%. In addition to serving as a resource for reducing Rubisco accumulation in a cell-preferential manner, these lines allow us to characterize gene function and isoform specific suppression on photosynthesis and growth. Our results suggest that the knockdown of multiple genes is required to completely reduce Rubisco accumulation in MCs.

Abstract Introduction of a C 4 photosynthetic pathway into C 3 rice ( Oryza sativa ) requires installation of a biochemical pump that concentrates CO 2 at the site of carboxylation in modified bundle sheath cells. To investigate the feasibility of this, we generated a quadruple line that simultaneously expresses four of the core C 4 photosynthetic enzymes from the NADP-malic enzyme subtype, phospho enol pyruvate carboxylase ( Zm PEPC), NADP-malate dehydrogenase ( Zm NADP-MDH), NADP-malic enzyme ( Zm NADP-ME) and pyruvate phosphate dikinase ( Zm PPDK), in a cell-specific manner. This led to enhanced enzyme activity but was largely neutral in its effects on photosynthetic rate and growth. Measurements of the flux of 13 CO 2 through photosynthetic metabolism revealed a significant increase in the incorporation of 13 C into malate, consistent with increased fixation of 13 CO 2 via PEP carboxylase in lines expressing the maize PEPC enzyme. We also showed 13 C labelling of aspartate indicating additional 13 CO 2 fixation into oxaloacetate by PEPC and conversion to aspartate by the endogenous aspartate aminotransferase activity. However, there were no significant differences in labelling of 3-phosphoglycerate (3PGA) or phospho enol pyruvate (PEP) indicating limited carbon flux through C 4 enzymes into the Calvin-Benson cycle. Crossing the quadruple line with a line with reduced glycine decarboxylase H-protein ( Os GDCH) abundance led to a photosynthetic phenotype characteristic of the reduced Os GDCH line and higher labelling of malate, aspartate and citrate. While Kranz anatomy or other anatomical modifications have not yet been installed in these plants to enable a fully functional C 4 cycle, these results demonstrate for the first-time flux through the carboxylation phase of C 4 metabolism in transgenic rice containing the key metabolic steps in the C 4 pathway.

The chloroplastic oxaloacetate/malate transporter (OMT1 or DiT1) takes part in the malate valve that protects chloroplasts from excessive redox poise through export of malate and import of oxaloacetate (OAA). Together with the glutamate/malate transporter (DCT1 or DiT2), it connects carbon with nitrogen assimilation, by providing α-ketoglutarate for the GS/GOGAT reaction and exporting glutamate to the cytoplasm. OMT1 further plays a prominent role in C4 photosynthesis. OAA resulting from PEP-carboxylation is imported into the chloroplast, reduced to malate by plastidic NADP-MDH, and then exported for transport to bundle sheath cells. Both transport steps are catalyzed by OMT1, at the rate of net carbon assimilation. Therefore, to engineer C4 photosynthesis into C3 crops, OMT1 must be expressed in high amounts on top of core C4 metabolic enzymes. We report here high-level expression of ZmOMT1 from maize in rice (Oryza sativa ssp. indica IR64). Increased activity of the transporter in transgenic rice was confirmed by reconstitution of transporter activity into proteoliposomes. Unexpectedly, over-expression of ZmOMT1 in rice negatively affected growth, CO2 assimilation rate, total free amino acid contents, TCA cycle metabolites, as well as sucrose and starch contents. Accumulation of high amounts of aspartate and the impaired growth phenotype of OMT1 rice lines could be suppressed by simultaneous over-expression of ZmDiT2. Implications for engineering C4-rice are discussed.