Abstract The global COVID-19 pandemic has caused massive disruptions in every society around the world. To help fight COVID-19, new molecular tools specifically targeting critical components of the causative agent of COVID-19, SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), are desperately needed. The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein is a major component of the viral replication processes, integral to viral particle assembly, and is a major diagnostic marker for infection and immune protection. Currently available antibody reagents targeting the nucleocapsid protein were primarily developed against the related SARS-CoV virus and are not specific to SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Therefore, in this work we developed and characterized a series of new mouse monoclonal antibodies against the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. The anti-nucleocapsid monoclonal antibodies were tested in ELISA, western blot, and immunofluorescence analyses. The variable regions from the heavy and light chains from five select clones were cloned and sequenced, and preliminary epitope mapping of the sequenced clones was performed. Overall, the new antibody reagents described here will be of significant value in the fight against COVID-19.

The COVID-19 pandemic pushed the demand for readily available monitoring tools, leading to the development of electrochemical point-of-care devices. This work presents an electrochemical capillary-driven immunoassay (eCaDI) device based on polyethylene terephthalate (PET) and adhesive films featuring a screen-printed carbon electrode (SPCE) for the detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) protein in clinical samples. The SPCE was modified with protein A and capture antibodies (Ab1) to ensure biomolecule immobilization and enhance sensitivity to detect N protein. The eCaDI automates an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) through sequential reagent delivery, allowing for one-step sample addition. This process involves the capture of the N protein by Ab1, followed by the automated delivery of HRP-labelled antibody and 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) followed by electrochemical detection through TMB reduction. The SPCEs are sensitive and selective for SARS-CoV-2 N protein and stable for four weeks. Inactivated virus was used to determine a limit of detection (LOD) of 627 PFU/mL. The results obtained through immunoassay on eCADI were consistent with those of the RT-PCR method, showing a coefficient of determination (R2) of 0.816 for 27 nasal swab samples from SARS-CoV-2 infected individuals. The developed eCADI is an alternative to conventional ELISA, given the device's low cost (less than $1), low consumption of samples and reagents, low waste generation, and short analysis time (5 min). Moreover, the immunoassay has shown potential for diagnosing COVID-19 in decentralized areas.