The Human Phenotype Ontology (HPO) project, available at http://www.human-phenotype-ontology.org, provides a structured, comprehensive and well-defined set of 10,088 classes (terms) describing human phenotypic abnormalities and 13,326 subclass relations between the HPO classes. In addition we have developed logical definitions for 46% of all HPO classes using terms from ontologies for anatomy, cell types, function, embryology, pathology and other domains. This allows interoperability with several resources, especially those containing phenotype information on model organisms such as mouse and zebrafish. Here we describe the updated HPO database, which provides annotations of 7,278 human hereditary syndromes listed in OMIM, Orphanet and DECIPHER to classes of the HPO. Various meta-attributes such as frequency, references and negations are associated with each annotation. Several large-scale projects worldwide utilize the HPO for describing phenotype information in their datasets. We have therefore generated equivalence mappings to other phenotype vocabularies such as LDDB, Orphanet, MedDRA, UMLS and phenoDB, allowing integration of existing datasets and interoperability with multiple biomedical resources. We have created various ways to access the HPO database content using flat files, a MySQL database, and Web-based tools. All data and documentation on the HPO project can be found online.

The demand for platelets in England was stable at around 220 000 adult therapeutic doses (ATD) per year until 2007/8 at which point demand has increased year-on-year to 275 000 ATD in 2014/15, an increase of 25%. Similar rises in demand have been seen in Australia and the United States. A recent review which considered causes for this dramatic rise identified that an ageing population and an increase in the incidence of haematological malignancies (with increased treatment intensity, duration and survival) accounted for most of this change (Estcourt, 2014). In 2012 the population in the UK aged over 70 years was 7·5 million. By 2046 this number is expected to reach 15 million (Office of National Statistics (ONS) 2013). In addition, since 1990, the number of haematopoietic stem cell transplants performed in Europe has risen, from 4200 to over 30 000 annually (Passweg et al, 2012). Although a national audit of platelet use in haematology identified that 28% of transfusions were outside of guidelines (Estcourt et al, 2012a), these findings demonstrate less inappropriate use than a previous audit (Qureshi et al, 2007). An increase in the proportion of inappropriate use is therefore unlikely to have contributed significantly to recent changes in demand (Estcourt, 2014). Currently up to 67% of all platelets are used in the management of patients with haematological malignancies (Cameron et al, 2007; Greeno et al, 2007; Pendry & Davies, 2011; Jones et al, 2013; Charlton et al, 2014). Much of the remainder are used in cardiac surgery (7–10%) and in intensive care (5–9%). In contrast to platelet demand, the donor base is steadily dropping, with a 35% reduction in active donors from 1·893 million in 2000 to 1·231 million in 2015 (NHS Blood & Transplant, unpublished data). As the majority of platelets in the UK are collected from approximately 14 000 registered platelet donors (apheresis platelets), and whole blood donors give blood on average 1·7 times a year this could have a significant impact on the future supply (European Blood Alliance 2015, European Committee (Partial Agreement) on Blood Transfusion CD-P-TS 2016). This guideline aims to provide practical advice on platelet transfusions to help clinicians to decide when support is expected to be beneficial and to reduce inappropriate use. If the reason for thrombocytopenia is unclear, further investigation is required as this is likely to influence management. This document will cover practice in adults relevant to the UK and replace the 2003 British Committee for Standards in Haematology (BCSH) platelet use guideline (British Committee for Standards in Haematology Blood Transfusion Task Force 2003). A one page summary document is available in Appendix 1. The indications for platelet transfusion in children and neonates and more general specifications, such as cytomegalovirus (CMV) status and irradiation, are not included, and can be found elsewhere (New et al, 2016; Advisory Committee on the Safety of Blood, Tissues and Organs (SaBTO) 2012, Treleaven et al, 2011). The classification of platelet transfusion into either ‘therapeutic’, to treat bleeding, or ‘prophylactic’, to prevent bleeding, was based on the modified World Health Organization (WHO) bleeding score (Table 1) (Stanworth et al, 2013a). Recommendations for prophylactic transfusion relate to patients with bleeding scores of 0 or 1 and therapeutic transfusion to patients with bleeding scores of 2 or higher. For each indication, the recommendations include a threshold or target platelet count and a suggested dose, when relevant. The Grading of Recommendations, Assessment, Development and Evaluation (GRADE) nomenclature [Audit tool (Appendix S1)] was used to evaluate levels of evidence and to assess the strength of recommendations. The GRADE criteria are specified on the BCSH website (http://www.bcshguidelines.com/BCSH_PROCESS/42_EVIDENCE_LEVELS_AND_GRADES_OF_RECOMMENDATION.html) and the GRADE working group website (http://www.gradeworkinggroup.org). A search of published literature was undertaken using the evidence from several systematic reviews that are either currently being undertaken by members of the writing group (Estcourt et al, 2014a,b,c), or that have been recently published (Hedges et al, 2007; van Veen et al, 2010; Lieberman et al, 2013; Pavenski et al, 2013; Wardrop et al, 2013; Kumar et al, 2014; Vassallo et al, 2014; Crighton et al, 2015; Nahirniak et al, 2015). This was supplemented by searching PubMed and the United Kingdom Blood Transfusion Services (UKBTS)/Systematic Review Initiative (SRI) Transfusion Evidence Library (www.transfusionevidencelibrary.com) up to November 2014 using specific search terms relevant to each section of the guidelines. The guideline group was selected to be representative of UK-based medical (anaesthetics, benign and malignant haematology, haemostasis, transfusion) and laboratory experts with practical experience in platelet transfusion. Given the breadth of application, the draft guideline was provided to sounding board members of the Haemato-oncology, General Haematology, Haemostasis and Thrombosis, and Transfusion Task Forces of the BCSH for comment and subsequent revision. Recommendations for Prophylactic Transfusion of Platelets to Patients with Thrombocytopenia Because Of Reversible Bone Marrow Failure Where Recovery Is Anticipated: Recommendations for Prophylactic Transfusion of Platelets to Patients with Thrombocytopenia Because Of Chronic Bone Marrow Failure, Where Recovery Is Not Anticipated: Recommendations for Prophylactic Transfusion of Platelets to Other Patient Groups: Recommendations for Prophylactic Platelet Transfusion Prior To Procedures or Surgery: Recommendations for Therapeutic Platelet Transfusions: Recommendations for Platelet Function Disorders (Congenital): Recommendations for Platelet Function Disorders (Acquired): Recommendations for Immune Thrombocytopenia (ITP): Contraindications to Platelet Transfusions: Risks from Platelet Transfusions: Recommendations for Platelet Refractoriness: Recommendations for Other Alternatives or Additions to Platelet Transfusion: The evidence for these recommendations is based on studies in patients with haematological malignancy causing thrombocytopenia due to the disease or its treatment. Other patient populations are considered separately. A systematic review identified six randomised controlled trials (RCTs) that compared a prophylactic versus therapeutic platelet transfusion strategy (Crighton et al, 2015). Four of the included studies were conducted at least 30 years ago and used out-dated methods of platelet component production and patient supportive care. Two of the included studies were recent large RCTs (Wandt et al, 2012; Stanworth et al, 2013a), both of which showed that prophylactic platelet transfusions reduced the risk of bleeding when all patients with haematological malignancies receiving treatment (e.g. chemotherapy or transplantation) were considered (Crighton et al, 2015), but this effect was not seen in a pre-specified sub-group ‒ patients receiving autologous haematopoietic stem cell transplants (HSCT) (Table 2) (Stanworth et al, 2014). This finding indicates that prophylactic transfusion should continue to be the standard of care in patients receiving intensive chemotherapy or allogeneic transplantation but may not be appropriate in low risk groups with short periods of thrombocytopenia. A systematic review identified three RCTs that compared different platelet transfusion thresholds (Estcourt et al, 2012b). Two compared a threshold of 20 × 109/l vs. 10 × 109/l, whereas the third compared a threshold of 30 × 109/l vs. 10 × 109/l. A fourth RCT excluded from the systematic review compared a threshold of 20 × 109/l vs. 10 × 109/l (Zumberg et al, 2002). A meta-analysis of all four studies (658 patients) showed that the 10 × 109/l threshold was not associated with increased bleeding in comparison with a higher threshold and also showed a significant reduction in the number of platelet transfusions given (Estcourt et al, 2011). However, this meta-analysis may not be sufficiently powered to detect an increased bleeding risk in this lower threshold arm of less than 50% (Estcourt et al, 2011). The use of other transfusion thresholds, such as platelet mass, absolute immature platelet numbers and immature platelet fraction, have been considered as alternatives to a platelet count threshold but there have been no randomised studies in adult patients. (Eldor et al, 1982; Briggs et al, 2006; Gerday et al, 2009; Zisk et al, 2013). A systematic review identified six RCTs that compared different platelet transfusion doses (Estcourt et al, 2015). Four of these studies assessed clinically significant bleeding as an outcome measure (usually defined as WHO grade 2 or above). There was no evidence of a difference in the risk of bleeding between low dose (1·1 × 1011/m2) and standard dose (2·2 × 1011/m2) and between standard dose and high dose platelet transfusions (4·4 × 1011/m2). Low dose transfusions decreased the total amount of platelets patients received, but at the expense of a higher number of transfusions episodes. Increasing the dose from a standard to a high dose did not increase the transfusion interval (median 5 days for both regimens). The mean UK adult platelet dose (one unit of platelets) is around 3 × 1011 platelets, equivalent to between the low and standard doses defined above, although there is evidence of considerable variation (Pietersz et al, 2012). Numerous clinical factors have been reported to be associated with an increased risk of bleeding (Table 3). However, the majority of these postulated risk factors are based on low-level evidence, such as expert opinion or retrospective analysis of patient databases. Inflammation has been shown to be associated with an increased risk of bleeding in mice (Goerge et al, 2008). Although studies have differed in their opinion of whether fever increases the risk of bleeding in humans (Table 3), currently, the platelet transfusion threshold is commonly raised to 20 × 109/l when patients have an infection or fever (Estcourt et al, 2012a). Further studies are required to clearly identify which factors should prompt an increase in the transfusion threshold, and what this threshold should be. r = 0·174 (major haemorrhage) P < 0·001 r = 0·054 (minor haemorrhage) P < 0·001 r = 0·064 (major haemorrhage) P < 0·001 r = 0·114 (minor haemorrhage) P < 0·001 r = −0·101 (major haemorrhage) P < 0·001 r = −0·144 (minor haemorrhage) P < 0·001 OR 1·14 (95% C.I. 0·89–1·46) (not transfused) OR 0·98 (95% C.I. 0·69–1·39) (transfused) Other co-morbidities Splenomegaly Other co-morbidities Recent history of severe haemorrhage (≤5 days) There is little evidence to inform practice. A retrospective study considered platelet transfusion in outpatients with stable chronic severe aplastic anaemia (AA) (Sagmeister et al, 1999). Prophylactic platelets were given if the count was 5 × 109/l or less. In total, 55 239 patient days were reviewed of which there were 18 706 days when the platelet count was 10 × 109/l or less. All deaths from haemorrhage were associated with alloimmunisation or withdrawal from treatment. Three non-fatal major bleeding episodes occurred. The authors concluded that this restrictive policy, with a median transfusion interval of 7 days, was feasible, safe and economical. International guidelines that consider patients with chronic thrombocytopenia recommend either a ‘no prophylaxis’ strategy (Schiffer et al, 2001; Liumbruno et al, 2009; Kaufman et al, 2015) or prophylaxis below a count of 5 × 109/l (The Board of the German Medical Association on the Recommendation of the Scientific Advisory Board 2009). A major concern in using a threshold of 5 × 109/l is the reported inaccuracy of current automated counters when the platelet count is very low (Segal et al, 2005; De la Salle et al, 2012). A policy of prophylaxis has an impact on resources and on patient quality of life. Recent BCSH guidelines for the diagnosis and management of adult AA and for the diagnosis and management of adult myelodysplastic syndromes (Killick et al, 2014, 2015) advise a no prophylaxis strategy for patients who are not receiving active treatment, with the latter including patients taking low dose oral chemotherapy or azacitidine (Killick et al, 2014). Platelet function defects, immune-mediated thrombocytopenia and thrombotic thrombocytopenic purpura are considered in later sections. There is little evidence to guide practice in other patient populations. One patient group who are significant users of prophylactic platelet transfusions are those in critical care. A large observational study of critically ill patients showed that 9% (169/1923) of all critically ill patients received platelet transfusions and 55% (296/534 units) of these were given on days when no significant bleeding occurred (Stanworth et al, 2013b). The optimal platelet transfusion management of these patients (Lieberman et al, 2013) may differ depending upon the underlying clinical diagnosis (Assir et al, 2013). As the evidence base in non-haematological patients is sparse we have extrapolated the evidence from studies in haematology patients to this population as a basis for our recommendation until further evidence is available. According to the confidential registry of complications after bone marrow aspirates and trephines the risk of significant bleeding is very low (less than 1 in 1000), and the majority of patients with bleeding did not have significant thrombocytopenia (Table 4). Maintaining pressure on the biopsy site until bleeding has stopped is advised. Seventeen observational studies have reported bleeding outcomes in thrombocytopenic patients after insertion of central venous catheters (CVCs) (Table 5). Only one case of severe bleeding (Hb drop >15 g/l) was reported throughout all of these studies (Weigand et al, 2009). Three studies reported on risk factors, in addition to thrombocytopenia, associated with bleeding. In two of these studies ultrasound guidance was not used and, on multivariate analysis, the risk of bleeding was significantly increased by the number of attempts, site of insertion (jugular versus subclavian) and failed guide-wire insertion (Barrera et al, 1996; Fisher & Mutimer, 1999). In the third study, where ultrasound guidance was used, no such correlation was identified (Zeidler et al, 2011). Systematic reviews of complications of CVC placement (Randolph et al, 1996; Hind et al, 2003) and a more recent small study (Tomoyose et al, 2013) found that ultrasound guidance significantly reduced failure and complication rates. Observational Retrospective 115 (NR) 0 (0) Observational Retrospective 1825 (2010) INR > 1·3 aPTT > 37 s 3 (0) Observational Retrospective 40 (259) PT <40% aPTT ≥ 77 s 0 (0) Observational Prospective 115 (115) 20 (0) Observational Prospective 1660 (1978) Observational Retrospective 0 (0) 76 (104) 7 (0) Observational Prospective 283 (658) 19 (0) Observational Retrospective 2514 (3170) 0 (0) Observational Retrospective 80 (80) 0 (0) Observational Prospective 105 (112) 0 (0) 133 (133) NR (0) 72 (108) 4 (0) Observational Prospective 196 (NR) NR (1) Observational Retrospective 193 (604) 5 (0) Observational Retrospective 55 (57) 10 (0) Observational Retrospective 1 (0) Zeidler et al (2011) looked at the risk of bleeding according to platelet count thresholds with multivariate analysis. All CVCs were un-tunnelled and inserted by experienced individuals and the analysis was controlled for sex, type of leukaemia, insertion site and use of prophylactic platelet transfusions. The risk of bleeding only increased when the platelet count was less than 20 × 109/l (Odds ratio 2·88, 95% confidence interval 1·23–6·75, P = 0·015) (Zeidler et al, 2011). In a large study by Haas et al (2010), tunnelled CVCs were installed and all bleeding episodes were effectively controlled by simple pressure at the site of insertion. The platelet count threshold for insertion was 25 × 109/l (Haas et al, 2010). One additional prospective study assessed insertion of peripherally inserted central catheters (PICCs) without prophylactic platelet transfusions (Potet et al, 2013). Among the 50 patients who had a line inserted with a platelet count less than 20 × 109/l, only one bleeding episode occurred (minor oozing). One prospective non-randomised study assessed the risk of bleeding after traction removal of tunnelled cuffed CVCs in patients with abnormal platelet counts or an increased International Normalised Ratio (INR) (Stecker et al, 2007). Of the 179 patients enrolled in the study, 14 had a time to haemostasis of over 5 min and only one of these patients had a platelet count <100 × 109/l. A wide-ranging review of the literature has been performed to assess the risk of spinal haematoma following lumbar puncture and spinal and epidural anaesthesia. The evidence was based on case series, case reports and expert opinion. There was insufficient information to consider epidural and spinal anaesthesia separately (van Veen et al, 2010). The authors recommend that providing the platelet count is stable and no additional coagulopathy or platelet function defect is present a platelet count of ≥80 × 109/l should be used for placing/removing an epidural catheter or performing spinal anaesthesia and a count of ≥40 × 109/l for lumbar puncture (van Veen et al, 2010). As the technique for spinal anaesthesia is comparable to that of a lumbar puncture, a count of ≥40 × 109/l for both of these procedures and a separate threshold of 80 × 109/l for epidural anaesthesia would be more logical. We are aware of no new studies that have contributed to the literature since this review. A total of 2740 percutaneous liver biopsies were conducted in the Hepatitis C Antiviral Long-term Treatment against Cirrhosis (HALT-C) trial (Seeff et al, 2010); only 16 patients (0·6%) had a serious adverse event due to bleeding. Percutaneous liver biopsies are considered safe when the platelet count is at least 50–60 × 109/l (British Society of Gastroenterologists (BSG) 2004, Rockey et al, 2009). Below this level, transjugular liver biopsy (TJLB) should be considered. This procedure has been shown to be safe in patients with low platelet counts and with modern techniques can produce comparable histological samples to those from a percutaneous route (Wallace et al, 2003; Kalambokis et al, 2007; Mammen et al, 2008). Patients with uraemia have a platelet dysfunction that is thought to be associated with von Willebrand factor (Hedges et al, 2007). Uncontrolled hypertension, high serum creatinine, anaemia, older age and female sex have been shown to be risk factors for bleeding following renal biopsy and to prolong the bleeding time (Manno et al, 2004; Whittier, 2004; Torres Munoz et al, 2011; Zhu et al, 2014). Reversal of these problems by treatment of hypertension (Zhu et al, 2014), dialysis (Hedges et al, 2007; Mannucci, 2012), the use of desmopressin (Mannucci et al, 1983; Hedges et al, 2007; Manno et al, 2011) or conjugated oestrogens (Mannucci, 2012) and the correction of anaemia (Hedges et al, 2007) have all been reported to reduce the risk of bleeding in non-RCTs. Although treatment of anaemia with recombinant human erythropoietin can take many weeks a more rapid effect on haemostasis has been noted. This may be through improved platelet adhesion and aggregation (Zwaginga et al, 1991; Cases et al, 1992) and an increase in the number of reticulated platelets within 7 days (Tàssies et al, 1998). Transjugular renal biopsy has been used in patients in whom percutaneous renal biopsy has failed or been contraindicated and has produced a similar diagnostic yield and safety profile (Cluzel et al, 2000). Platelet transfusion is likely to be ineffective or, at best, very short-lived as the same dysfunction affecting the patient's own platelets will be acquired. The transfusion may also be harmful in patients who progress to renal transplant, because of the risk of alloimmunisation (Scornik et al, 2013). One recent small RCT (23 patients requiring 35 procedures and 84 teeth removed) has shown a low rate of bleeding complications without blood product support, in patients prior to liver transplantation (Perdigão et al, 2012). Patients had platelet counts ≥30 × 109/l, an INR ≤ 3·0 and were randomised to the presence or absence of TXA on gauze used to apply local pressure. A third of patients had a platelet count <50 × 109/l. Only one patient in the control arm had post-operative bleeding, which was controlled with local pressure. Further research is required before a recommendation can be made to use local haemostatic measures alone. There remains a lack of evidence to guide the prophylactic use of platelet transfusions before major surgery. Guidelines from around the world suggest a threshold of 50 × 109/l before major surgery (British Committee for Standards in Haematology Blood Transfusion Task Force 2003, Samama et al, 2006; Liumbruno et al, 2011; Vassallo et al, 2013), and a threshold of 100 × 109/l prior to neurosurgery or ophthalmic surgery involving the posterior segment of the eye, because of the critical sites involved (British Committee for Standards in Haematology Blood Transfusion Task Force 2003, Samama et al, 2006; Liumbruno et al, 2011; Vassallo et al, 2013). Cataract surgery is an avascular procedure and therefore platelet transfusions are not routinely required. Measurement of the platelet count increment following platelet transfusion pre-procedure is desirable, but may be limited by the circumstances. There is little evidence for the effectiveness of platelet transfusions or the optimal dose when a patient with thrombocytopenia is actively bleeding i.e. WHO grade 2 or above (Estcourt et al, 2013). This may reflect the challenges involved in conducting trials in these often complex clinical settings and also the fact that platelet dysfunction may develop with major exsanguinating bleeding that is not captured by measuring the platelet count (Wohlauer et al, 2012). One recent large national audit reported the resolution of bleeding after a therapeutic platelet transfusion in 58% of cases with clinically significant bleeding (WHO grade 2 or above) (Estcourt et al, 2012a). Current recommendations are based on consensus guidelines from around the world (British Committee for Standards in Haematology Blood Transfusion Task Force 2003, Samama et al, 2006; Rossaint et al, 2010; Liumbruno et al, 2011, National Blood Authority 2011; Spahn et al, 2013; Vassallo et al, 2013) and recently revised BCSH guidelines for major haemorrhage (Hunt et al, 2015). Glanzmann Thrombasthenia (GT) is usually a severe bleeding disorder in which many patients do not express αIIbβ3 integrin on the platelet surface. This increases the risk of alloimmunisation to platelet antigens and refractoriness to platelet transfusion, which may prevent the effective treatment of bleeding (Hayward et al, 2006; Bakdash et al, 2008). Recombinant Factor VIIa (rFVIIa; NovoSeven, Novo Nordisk Limited, Bagsværd, Denmark) is licensed as a pro-haemostatic treatment in GT patients with anti-platelet antibodies and platelet refractoriness. However, most UK experts also advocate rFVIIa first line for the treatment or prevention of bleeding in GT, and that rFVIIa plus platelet transfusion should be considered for refractory bleeding or before high bleeding-risk surgery (Bolton-Maggs et al, 2006). In less severe heritable platelet function disorders, including Bernard-Soulier syndrome, TXA and desmopressin may be sufficient for haemostasis. If a patient has recently ingested an anti-platelet agent, any platelets transfused prior to or during the onset of action of the drug will acquire the same defect as the patients’ own platelets (Makris et al, 2013) (Table 6). The effect of platelet transfusion to control bleeding outside of this critical period is unclear. A recent RCT of 190 adults taking anti-platelet agents with spontaneous intracranial haemorrhage found no evidence to support the use of platelet transfusions (Baharoglu et al, 2016). This confirms the findings of two systematic reviews examining the treatment of adults on anti-platelet agents with spontaneous or traumatic intracranial haemorrhage which found no evidence of a benefit, however all included studies were of low or very low quality (Batchelor & Grayson, 2012; Nishijima et al, 2012). In vitro experiments and a case report suggest that platelet dysfunction caused by aspirin is much easier to correct with platelet transfusion than treatment with clopidogrel or ticagrelor (Vilahur et al, 2007; Li et al, 2012; Hansson et al, 2014; Godier et al, 2015). A pilot study in 14 healthy volunteers supported these in vitro findings, as two units of platelets was shown to overcome clopidogrel-induced low platelet reactivity but there was no improvement in ADP-induced platelet aggregation (Pruller et al, 2011). <1 h 3–4 h with enteric-coated preparations 2 h 4–5 h with enteric-coated preparations Platelet transfusion to reverse the effects of aspirin is usually unnecessary as, although it increases the risk of surgical bleeding 1·5-fold, it does not increase bleeding severity for most procedures (Makris et al, 2013). In addition to concerns regarding efficacy of platelet transfusion for anti-platelet agents other than aspirin, many patients who are prescribed these drugs are at high risk of arterial thrombosis and a platelet transfusion may increase this risk (Makris et al, 2013). In the RCT of spontaneous intracranial haemorrhage in patients on anti-platelet agents (Baharoglu et al, 2016), as well as no evidence of benefit, the odds of death or disability at 3 months were higher in those who received platelet transfusion compared to those who received standard care. In a pilot study of 14 patients administered two units of platelets 1–2 h prior to urgent surgery to “transiently reverse” the effects of aspirin and clopidogrel, one patient developed acute coronary syndrome 4 days after surgery (aspirin and clopidogrel had been started 6 and 24 h after surgery, respectively) (Thiele et al, 2012). In contrast, TXA has been used in three RCTs in patients taking clopidogrel (with or without aspirin) before coronary artery bypass grafting (total 766 patients) and significantly reduced blood transfusion requirements (Ahn et al, 2012; Shi et al, 2013a,b). No differences in adverse events were reported between the groups; however, the authors advised caution regarding the small numbers and limited follow-up (in the two largest studies follow-up was for 1 year). Management of the acquired anti-platelet effect of uraemia is discussed in the section above on Platelet transfusion prior to procedures and surgery under ‘Renal biopsy’. ITP is an acquired immune-mediated disorder characterised by isolated thrombocytopenia (platelet count <100 × 109/l), in the absence of any obvious underlying cause (Provan et al, 2010). Signs and symptoms vary widely; some patients have little or no bleeding, whereas others can experience life-threatening/fatal haemorrhage. Platelet transfusions are not recommended as prophylaxis (Provan et al, 2010). The Obstetric Anaesthetists’ Association advise that for ITP and gestational thrombocytopenia, if the patient and platelet count are stable and the coagulation screen normal, neuroaxial blockade can be done when the count is >50 × 109/l when performed by a skilled and experienced anaesthetist (Lyons & Hunt, 2010). Platelets have been used, often in association with other treatments, to treat major bleeding (Neunert et al, 2011). There are no RCTs; publications consist of case reports, observational studies and uncontrolled interventional studies. A review of these studies (Table 7) shows that high-dose or high-frequency platelet transfusions have been effective at stopping bleeding, even if the platelet count has not been affected. A platelet count rise appears to be more sustained if platelet transfusions and intravenous immunoglobulin are administered together (Baumann et al, 1986; Spahr & Rodgers, 2008), and one study suggests this combination is more effective clinically (Spahr & Rodgers, 2008). M (2) F (4) 8 units plt tx Then 400 mg/kg IVIG + 8 units plt tx Plt increment after IVIG + plt tx (median: 68 × 109/l; range: 20–130); time to baseline >60 h Plt tx alone (median: 31; range: 18–33) Median time to baseline: 6 h M (3) F (7) Severe bleeding (5) GI bleed (2) 1 unit every 30 min 3–7 apheresis units (2·7 × 1011 plts per unit) M (4) F (7) Idiopathic (6) Quinidine-induced (5) CNS (2) Epistaxis (6) Upper GI (2) Petechiae alone (1) Idiopathic (6) Quinidine (1) Plt Tx. Median/pt 2 (Range 1–6) Pooled (28 plt tx) Apheresis (3 plt tx) Idiopathic (1) bleeding improved despite poor plt increment Quinidine (2) bleeding decreased or stopped M (23) F (17) Idiopathic (9 previously refractory to IVIG alone) IVIG (1 g/kg) continuous infusion over 24 h Plt apheresis unit (1 unit every 8 h) Guidelines on the diagnosis and management of HIT have been published (Watson et al, 2012). It has been widely stated that giving a platelet transfusion may increase the risk of thrombosis (Hopkins & Goldfinger, 2008; Warkentin, 2011; Linkins et al, 2012). However, the evidence for this is poor and based on two case series from the 1970s (16 patients in total) (Babcock et al, 1976; Cimo et al, 1979). Two more recent case series (41 patients in total) have reported no association with thrombosis (Hopkins & Goldfinger, 2008; Refaai et al, 2010). This is a rare condition associated with severe thrombocytopenia following blood transfusion and caused by antibodies against platelet-specific antigens. Bleeding can be serious and fatal. The incidence has reduced since the introduction of universal leucodepletion. Multiparous women are the main

Most patients with rare diseases do not receive a molecular diagnosis and the aetiological variants and causative genes for more than half such disorders remain to be discovered1. Here we used whole-genome sequencing (WGS) in a national health system to streamline diagnosis and to discover unknown aetiological variants in the coding and non-coding regions of the genome. We generated WGS data for 13,037 participants, of whom 9,802 had a rare disease, and provided a genetic diagnosis to 1,138 of the 7,065 extensively phenotyped participants. We identified 95 Mendelian associations between genes and rare diseases, of which 11 have been discovered since 2015 and at least 79 are confirmed to be aetiological. By generating WGS data of UK Biobank participants2, we found that rare alleles can explain the presence of some individuals in the tails of a quantitative trait for red blood cells. Finally, we identified four novel non-coding variants that cause disease through the disruption of transcription of ARPC1B, GATA1, LRBA and MPL. Our study demonstrates a synergy by using WGS for diagnosis and aetiological discovery in routine healthcare. Whole-genome sequencing and phenotype data sharing are introduced in a national health system to streamline diagnosis and to discover coding and non-coding variants that cause rare diseases.

Summary The guideline writing group was selected to be representative of UK‐based medical experts. MEDLINE was systematically searched for publications in English up to the Summer of 2010 using key words platelet, platelet function testing and platelet aggregometry. Relevant references generated from initial papers and published guidelines/reviews were also examined. Meeting abstracts were not included. The writing group produced the draft guideline, which was subsequently revised and agreed by consensus. Further comment was made by members of the Haemostasis and Thrombosis Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. The guideline was then reviewed by a sounding board of approximately 40 UK haematologists, the British Committee for Standards in Haematology (BCSH) and the British Society for Haematology Committee and comments incorporated where appropriate. Criteria used to quote levels and grades of evidence are as outlined in appendix 7 of the Procedure for Guidelines Commissioned by the BCSH [ http://www.bcshguidelines.com/BCSH_PROCESS/EVIDENCE_LEVELS_AND_GRADES_OF_RECOMMENDATION/43_GRADE.html ]. The objective of this guideline is to provide healthcare professionals with clear guidance on platelet function testing in patients with suspected bleeding disorders. The guidance may not be appropriate to patients receiving antiplatelet therapy and in all cases individual patient circumstances may dictate an alternative approach.

The objective of this document is to guide diagnosis and management of patients with rare coagulation disorders (RCD). This document replaces the 2004 UK Haemophilia Centre Doctors' Organization (UKHCDO) rare coagulation disorders guideline (Bolton-Maggs et al, 2004a). The RCD are here defined as monogenic bleeding disorders caused by deficiency of a soluble coagulation factor or factors, other than von Willebrand disease (VWD), Haemophilia A or Haemophilia B. The RCD described in this document include heritable deficiencies of fibrinogen, prothrombin, factor (F) V, FVII, FX, FXI and FXIII, combined FV and FVIII deficiency and vitamin K-dependent coagulation factor deficiency. RCD are usually caused by recessive inheritance of unique or rare nucleotide variations in the genes encoding the coagulation factors or in proteins necessary for their post-translational processing. RCD are more common in ethnic groups in which consanguineous partnerships are common, because of the higher likelihood of homozygosity. Dysfibrinogenaemia and FXI deficiency may show autosomal dominant or recessive inheritance (Table 1). Heterozygous carriers of variations in other classically 'recessive' RCDs sometimes display bleeding symptoms. 1:1 million (AR) Unknown (AD) 1:1 million (AR) 1:30 000 (AD) The writing group was representative of UK experts in RCD. Evidence was gathered from primary English language publications identified in PubMed from 1990 using the disorder names and synonyms as index terms. Relevant reviews and other guidelines were also searched for informative primary publications. The writing group produced a draft guideline that was revised by consensus by the UKHCDO Advisory Group and the Haemostasis and Thrombosis Task Force of the British Committee for Standards in Haematology (BCSH) and the BCSH Executive Committee. The guideline was then reviewed by a sounding board of 50 members of the British Society for Haematology (BSH) who have commented on its content and applicability in the UK setting. The strength of recommendations and quality of evidence are presented in GRADE format http://www.bcshguidelines.com/BCSH_PROCESS/EVIDENCE_LEVELS_AND_GRADES_OF_RECOMMENDATION/43_GRADE.html. Published descriptions of the RCD have historically comprised case reports or short series. However, initiatives, such as the European Network of Rare Bleeding Disorders (EN-RBD; Peyvandi et al, 2012a), the North American Rare Bleeding Disorders Registry (Acharya et al, 2004) and several disease-specific registries (Herrmann et al, 2006, 2009; Ivaskevicius et al, 2007; Bernardi et al, 2009) have improved understanding of the RCD. This has enabled the EN-RBD, under the auspices of the International Society of Thrombosis and Haemostasis to propose laboratory criteria of disease severity for most RCD (Table 1; Peyvandi et al, 2012a). Despite this progress, the clinical characteristics of many RCD remain incompletely documented and management is informed by open label observational studies and not randomized controlled trials. Therefore, the quality of most evidence considered in this guideline is moderate (B) or low (C) and most recommendations are weak (2). This document is intended to guide factor replacement or other therapies for most clinical scenarios. However, clinicians are expected to modify treatment plans according to the severity of individual bleeds or procedures and to the background bleeding phenotype of each case. Further guidance about laboratory evaluation, selection of therapeutic products and the management of women with RCD, including regional anaesthesia, is provided in previous UKHCDO or BCSH guidelines (Lee et al, 2006; Keeling et al, 2008). In common with other heritable bleeding disorders, the treatment and prevention of bleeding in the RCD requires general measures, such as avoiding high bleeding risk activities, selecting invasive procedures with the minimum bleeding risk and ensuring adequate communication of treatment plans developed by haemophilia centres with appropriate expertise. Consideration should be given to adjunctive treatments, such as topical pro-haemostatic agents and endocrine therapy for heavy menstrual bleeding (HMB; Keeling et al, 2008; Peyvandi et al, 2013). Tranexamic acid or other anti-fibrinolytics may be sufficient for HMB and for minor bleeds, particularly at sites such as the oropharyngeal mucosa. Tranexamic acid may also be a useful adjunct to factor replacement, but is relatively contraindicated for renal tract bleeding and in cases with high thrombotic risk. For the prevention of surgical or obstetric bleeding, oral or intravenous tranexamic acid should be administered no later than 2 h before surgery or delivery to ensure peak plasma levels at the time of haemostatic challenge. Tranexamic acid should be used cautiously with prothrombin complex concentrate (PCC) or FXI concentrate because of thrombosis risk (Bolton-Maggs et al, 1994; Kohler, 1999), although more recent experience of tranexamic acid in combination with activated PCC in haemophilia inhibitor patients suggests that thrombosis risk may be low (Tran et al, 2014). Tranexamic acid is not licensed for use in children and should be used with caution in neonates. Replacement therapies for the RCD include recombinant factor concentrates of FXIII A-subunit and activated FVII (FVIIa) and plasma-derived factor concentrates of fibrinogen, FVII, FX, FXI and FXIII (Table 2). If available, specific recombinant or virally inactivated plasma-derived factor concentrates should be used in preference to fresh frozen plasma (FFP) or cryoprecipitate. Riastap (Fibrinogen) CSL Behring NovoSeven (rFVIIa) NovoNordisk Factor X (FX) Bioproducts laboratories (Elstree, UK) Factor XI concentrate (FXI) Bioproducts laboratories Hemoleven (Factor XI) LFB (Les Ulis, France) NovoThirteen (rFXIII-A) NovoNordisk Fibrogammin (FXIII) CSL Behring PCC are plasma-derived concentrates that are available as 'four factor' products containing FII, FVII, FIX and FX and as 'three factor' products without FVII (Table 3; Keeling et al, 2008). PCC may be useful in prothrombin deficiency, vitamin K-dependent clotting factor deficiency and in FX and FVII deficiency if a specific factor concentrate is unavailable. The potency of most PCC is expressed as FIX activity units, but the activities of the other constituent coagulation factors may vary between products and product batches (Table 3). High or repeated doses of PCC have been associated with arterial and venous thrombosis, usually in cases with pre-existing risk factors (Kohler, 1999). Beriplex P/N PCC (FII, VII, IX and X) CSL Behring Octaplex PCC (FII, VII, IX and X) Octapharma Standard fresh frozen plasma NHS Blood and Transplant (Watford, UK) OctaplasLG Pathogen-reduced plasma Octapharma Pathogen reduced cryoprecipitate NHS Blood and Transplant FFP is the only currently available replacement therapy for FV deficiency and combined deficiency of FV and FVIII, but may be effective in other RCD in emergencies if a more specific replacement therapy is unavailable or if diagnosis is uncertain. Cryoprecipitate may be effective in fibrinogen or FXIII deficiency if a single factor concentrate is unavailable (O'Shaughnessy et al, 2004). Should FFP or cryoprecipitate be necessary, it is currently recommended that all cases with heritable bleeding disorders receive pathogen-reduced products (Keeling et al, 2008). This requires virus inactivation either by methylene blue and light (MB-FFP) or solvent detergent (SD-FFP) treatments during manufacture, which may reduce FV, FVIII, FXI and fibrinogen content (Table 3; Williamson et al, 2003). Single donor MB-FFP supplied by UK NHS Blood and Transplant (NHS-BT) is currently quality controlled for FVIII activity (Williamson et al, 2003). The SD-FFP product Octaplas LG® (CSL Behring, Marburg, Germany) has mean FV, FVIII and FXI activities of 0·7–0·9 iu/ml and is quality controlled to ensure activities exceed 0·5 iu/ml (Table 3). The activities of other coagulation factors in SD-FFP are 0·8–1·0 iu/ml. As SD-FFP is prepared from pooled plasma donations, there is less variation in factor activities compared to single donor MB-FFP. MB-cryoprecipitate supplied by NHS-BT has an average fibrinogen content of 250 mg/unit and a minimum of 140 mg/unit. There are limited data describing the pharmacokinetics of coagulation factors administered via FFP or cryoprecipitate (Inbal et al, 1993; Horowitz & Pehta, 1998). Achieving therapeutic levels of coagulation factors, particularly with FFP, may be practically difficult because of the low starting concentration of factors in this product. Fibrinogen deficiency (F1D; MIM #202400) is an autosomal recessive or dominant disorder in which quantitative (afibrinogenaemia or hypofibrinogenaemia) or qualitative (dysfibrinogenaemia) defects in the fibrinogen Aα, Bβ or γ protein chains lead to reduced functional fibrinogen. Hypodysfibrinogenaemia describes F1D with both quantitative and qualitative fibrinogen defects. Afibrinogenaemia has an estimated prevalence of one in 1 000 000 (Mannucci et al, 2004). There are no reliable estimates of the prevalence of dysfibrinogenaemia. Fibrinogen is a complex glycoprotein comprising pairs of Aα, Bβ and γ chains and is the major ligand for the platelet αIIBβ3 integrin during platelet aggregation. Partial proteolysis of fibrinogen by thrombin enables polymerization to form fibrin clot (Weisel & Litvinov, 2013). Fibrinogen also has an anticoagulant effect, possibly by sequestering free thrombin, and contributes to fetal implantation and wound healing. Afibrinogenaemia is caused by variations in the FGA, FGB and FGG genes, which encode the fibrinogen Aα, Bβ and γ chains, respectively. Afibrinogenaemia is associated with homozygous or compound heterozygous mutations and hypofibrinogenaemia is usually linked with heterozygous mutations (de Moerloose et al, 2013). Dysfibrinogenaemia is usually associated with heterozygous mutations in FGA, FGB or FGG, clustered within specific functional domains (Haverkate & Samama, 1995; Miesbach et al, 2010; Shapiro et al, 2013). Some FGA variations cause hereditary renal amyloidosis, which is not associated with abnormal haemostasis (Gillmore et al, 2009). In 106 cases with afibrinogenaemia or hypofibrinogenaemia in US, Iranian and Indian registries, the most common symptoms were mucocutaneous, soft-tissue, joint, genitourinary, traumatic and surgical bleeding and HMB (Peyvandi & Mannucci, 1999; Acharya et al, 2004; Viswabandya et al, 2012). Intracranial bleeding was reported in 5% of registry cases. Similar symptoms and frequent umbilical bleeding were reported in 65 cases in Iranian and Palestinian case series (Fried & Kaufman, 1980; Lak et al, 1999) and in an international survey of 100 cases (Peyvandi et al, 2006). Arterial and venous thrombosis, poor wound healing and splenic rupture are rare features of afibrinogenaemia and hypofibrinogenaemia (de Moerloose et al, 2013). Some types of hypofibrinogenaemia are associated with liver disease because of retention of abnormal fibrinogen in hepatocytes (Brennan et al, 2000). In 26 cases with afibrinogenaemia or hypofibrinogenaemia in the EN-RBD registry, cases with severe bleeding had fibrinogen activity <0·9 g/l and asymptomatic cases had fibrinogen activity 0·2–2·0 g/l determined by the Clauss assay (Peyvandi et al, 2012a). Afibrinogenaemia and usually hypofibrinogenaemia manifest as prolonged prothrombin (PT), activated partial thromboplastin (APTT) and thrombin clotting (TCT) times and absent or reduced fibrinogen activity determined by the Clauss assay. There is a concordant reduction in fibrinogen antigen determined by immunoassay, gravimetric assays or by measurement of dry clot weight (Cunningham et al, 2002; Mackie et al, 2003). Assays that measure total clottable fibrinogen are an alternative that may assist diagnosis of F1D subtypes (Mackie et al, 2003). Acquired hypofibrinogenaemia is a feature of many acquired coagulopathies and can usually be distinguished from F1D on clinical grounds. Fibrinogen replacement with plasma-derived fibrinogen concentrate (Table 2) may be required to treat or prevent bleeding in F1D. In afibrinogenaemia, the recovery of fibrinogen activity after infusion of fibrinogen concentrate was 0·018 g/l per mg/kg and the half-life was 80 h, but it was shorter in children aged <16 years (Manco-Johnson et al, 2009). Therefore, a typical dose of fibrinogen concentrate of 4–6 g is expected to increase plasma fibrinogen activity by 1·0–1·5 g/l in a 70 kg adult. In a review of case reports (Bornikova et al, 2011) and in a questionnaire survey of physicians treating F1D (Peyvandi et al, 2006), fibrinogen concentrate 50–100 mg/kg every 2–4 d, to achieve fibrinogen activity >1·0–1·5 g/l was usually sufficient to treat or prevent spontaneous or surgical bleeding. Higher and more frequent dosing was required in children and in cases with severe bleeds or having major surgery (Peyvandi et al, 2006; Bornikova et al, 2011). Venous or arterial thrombosis occurred in 30% of cases in the case report series, most with afibrinogenaemia (Bornikova et al, 2011). In an open label prospective study, fibrinogen concentrate was effective in 26 bleeds and 11 surgical procedures in 12 cases with F1D. Venous thrombosis occurred in one case with other thrombotic risk factors (Kreuz et al, 2005). Fibrinogen isoantibody formation has not been reported in F1D. Pathogen-reduced cryoprecipitate has greater variation in fibrinogen content than fibrinogen concentrate and may be associated with transfusion reactions or volume overload (Table 3: O'Shaughnessy et al, 2004). A typical dose of 10–20 units (500–1000 ml) of MB-cryoprecipitate is expected to increase fibrinogen activity by 0·6–1·2 g/l in a 70 kg adult. The efficacy of cryoprecipitate is similar to that of fibrinogen concentrate (Peyvandi et al, 2006). Afibrinogenaemia may present with intracranial haemorrhage and umbilical bleeding (Lak et al, 1999; Peyvandi & Mannucci, 1999). Fibrinogen activity determined by the Clauss assay was reduced and the TCT prolonged in the healthy newborn compared to adults in some (Reverdiau-Moalic et al, 1996) but not other (Andrew et al, 1987) studies. This may be because the high sialic acid content of fetal fibrinogen affects some fibrinogen activity and TCT tests (Barr, 1978; Ignjatovic et al, 2011). Although diagnosis of afibrinogenaemia is straightforward on cord or neonatal blood samples, diagnosis of hypofibrinogenaemia requires comparison of test results with neonatal reference intervals and on re-testing at 3–6 months. Successful long-term prophylaxis with cryoprecipitate (Rodriguez et al, 1988; Peyvandi et al, 2006) or fibrinogen concentrate (Parameswaran et al, 2000; Kreuz et al, 2005; Peyvandi et al, 2006) has been reported in cases with afibrinogenaemia associated with intracranial bleeding. Typical regimens comprised fibrinogen concentrate 18–120 mg/kg, once per week to give trough fibrinogen activity of 0·5–1·0 g/l (Parameswaran et al, 2000; Peyvandi et al, 2006). Fibrinogen activity increases during normal pregnancy (Stirling et al, 1984). However, this does not prevent potential complications such as venous thrombosis, pregnancy loss, ante-partum haemorrhage (APH) and post-partum haemorrhage (PPH) in women with afibrinogenaemia and hypofibrinogenaemia (Goodwin, 1989; Dupuy et al, 2001; Roque et al, 2004; Kadir et al, 2009). Fibrinogen replacement helps maintain pregnancy and reduces bleeding. However, reports indicate that fibrinogen concentrate 5–30 g per week in 2–3 divided doses to maintain fibrinogen activity >0·6–1·0 and >1·5 g/l at delivery and post-partum does not prevent all pregnancy complications (Bornikova et al, 2011), possibly because these trough levels are inadequate. Higher doses of fibrinogen concentrate are required to maintain fibrinogen activity as pregnancy progresses (Roque et al, 2004). In a review of 250 reported cases with dysfibrinogenaemia, 53% were asymptomatic and 26% had bleeding that was typically mucocutaneous, traumatic or surgical (Haverkate & Samama, 1995). The remaining 21% of cases had venous or arterial thrombosis (Haverkate & Samama, 1995). Similar symptoms were reported in a series of 93 cases with dysfibrinogenaemia in which incidental diagnosis after routine coagulation tests or thrombophilia screens was also common (Miesbach et al, 2010; Shapiro et al, 2013). Thrombosis and bleeding may co-exist in the same case (Haverkate & Samama, 1995). Dysfibrinogenaemia may manifest as a prolonged PT and/or APTT depending on test reagent and methodology. The TCT and reptilase time are usually prolonged and there is a reduction in the Clauss fibrinogen activity, typically to 0·1–0·8 g/l. Some rare variants are associated with a shortened TCT (Cunningham et al, 2002; Mackie et al, 2003). As dysfibrinogenaemia is associated with a selective functional defect in fibrinogen activity, fibrinogen antigen or total clottable fibrinogen are not reduced. There is no association between fibrinogen activity and clinical phenotype in dysfibrinogenaemia, but some genotypes correlate with either bleeding or thrombosis (Haverkate & Samama, 1995). The PT-derived fibrinogen assay is not suitable for evaluation of dysfibrinogenaemia (Mackie et al, 2003). There are individual reports of cases with haemorrhagic dysfibrinogenaemia receiving fibrinogen concentrate (Kreuz et al, 2005). Thrombotic dysfibrinogenaemia has been managed with low molecular weight heparin for thromboprophylaxis and with coumarin anticoagulation for long-term prevention of thrombosis. Fibrinogen concentrate may have an anti-thrombotic effect by increasing the proportion of normal circulating fibrinogen molecules compared to endogenous thrombotic variant molecules. However, any therapeutic effect may be offset by the increased absolute fibrinogen concentration after concentrate infusion. There are no available data to guide optimum dosing of fibrinogen concentrate in thrombotic dysfibrinogenaemia. Women with dysfibrinogenaemia experience similar pregnancy complications to women with hypofibrinogenaemia. There are isolated case reports suggesting that these may be prevented by fibrinogen replacement throughout pregnancy (Yamanaka et al, 2003). Prothrombin (FII) deficiency (F2D; MIM #613679) is an autosomal recessive disorder in which reduced plasma prothrombin activity is caused by quantitative (hypoprothrominaemia) or qualitative (dysprothrombinaemia) defects in the FII protein. F2D has an estimated prevalence of one in 2 000 000 (Mannucci et al, 2004). FII is activated to the serine protease thrombin by activated FX in the initiation phase of coagulation, and by the prothrombinase complex in the amplification phase. Thrombin back-activates other coagulation factors and platelets and enables fibrin generation (Roberts et al, 2006). F2D is caused by variations in the F2 gene which encodes FII. There is a poor association between F2 genotype and clinical phenotype (Lancellotti et al, 2013). In 43 cases with F2D in the US, Iranian and Indian registries, the most common symptoms were mucocutaneous, soft tissue, joint and surgical bleeding and HMB. Less common symptoms were gastrointestinal, urinary, obstetric and umbilical bleeding. Intracranial haemorrhage was reported in 7% of registry cases (Peyvandi & Mannucci, 1999; Acharya et al, 2004). Similar symptoms were reported in a survey of 26 case reports (Girolami et al, 1998). Bleeding caused by F2D in hypoprothrombinaemia was more severe in cases with FII activity <0·1 iu/ml than in those with FII activity >0·1 iu/ml who typically experienced mild mucocutaneous bleeding (Acharya et al, 2004). In dysprothrombinaemia there is a poor association between clinical and laboratory phenotypes (Akhavan et al, 2000). Heterozygous F2D carriers have FII activities of 0·4–75 iu/ml and are typically asymptomatic (Girolami et al, 1998). F2D manifests as prolongation of the PT and APTT and reduced FII activity determined by one-stage PT-based assay, although test results may vary by reagent. Plasma FII antigen, determined by immunoassay, is necessary to distinguish hypo- and dysprothrombinaemia (Girolami et al, 1998; Akhavan et al, 2000). Clotting endpoint assays that utilize Echis carinatus, Taipan and textrarin snake venoms may differentiate some dysprothrombinaemia variants (Dumont et al, 1987). Acquired FII deficiency may occur in lupus anticoagulant-hypoprothrombinaemia syndrome which is distinguished from F2D on clinical grounds, PT and APTT mixing studies and the presence of antiphospholipid antibodies (Mazodier et al, 2012). FII replacement with PCC may be required to treat or prevent bleeding in F2D. PCC contain approximately equivalent FIX and FII activities and show FII activity recovery of 0·02 iu/ml per iu/kg and a half-life of 60 h (Table 1; Ostermann et al, 2007). Therefore, a typical therapeutic dose of PCC 20–30 (FIX) iu/kg is expected to increase plasma FII activity by 0·4–0·6 iu/ml. Similar doses at 2–3 d intervals may be necessary for sustained treatment (Lechler, 1999). If PCC is unavailable, pathogen-reduced FFP 15–25 ml/kg is expected to increase plasma FII activity by 0·3–0·4 iu/dl. FII alloantibodies have not been reported in F2D. Intracranial and umbilical bleeding may be presenting features of F2D (Strijks et al, 1999; Akhavan et al, 2000). FII activity is 0·26–0·70 iu/ml in healthy term neonates and reaches adult values at 6 months (Andrew et al, 1987). Therefore, diagnosis of F2D at delivery requires comparison of test results with neonatal reference intervals or testing after routine administration of vitamin K1 and at re-testing when 6 months old. There is limited experience of long term prophylaxis in F2D. PCC 20–40 (FIX) iu/kg every 5–7 d has been reported as effective in case reports (Todd & Perry, 2010). FII activity does not change significantly during normal pregnancy (Stirling et al, 1984), and usually remains insufficient for delivery in women with severe F2D. APH, pregnancy loss and PPH were identified in two case series of 22 pregnancies in women with F2D (Catanzarite et al, 1997; Peyvandi & Mannucci, 1999). Management had comprised PCC 20–40 iu/kg during labour (Catanzarite et al, 1997). Factor V (FV) deficiency (F5D; MIM 227400#) is an autosomal recessive disorder in which reduced plasma FV activity is caused by quantitative or, very rarely, qualitative defects in the FV protein. F5D has an estimated prevalence of one in 1 000 000 (Mannucci et al, 2004). FV is synthesized in hepatocytes and circulates approximately 80% in plasma and 20% in platelet α-granules. FV is activated by thrombin or activated FX to form a non-enzymatic cofactor for activated FX in the prothrombinase complex (Roberts et al, 2006). F5D is associated with variations in the F5 gene that encodes FV, which usually abolish FV expression (Thalji & Camire, 2013). There is a poor correlation between F5 genotype and the clinical phenotype of F5D. In 105 cases with F5D in the US, Iranian and Indian registries, the most common symptoms were mucocutaneous, soft-tissue, surgical and traumatic bleeding and HMB. Less common symptoms were joint, muscle, genitourinary, gastrointestinal and umbilical bleeding (Lak et al, 1998; Peyvandi & Mannucci, 1999; Acharya et al, 2004; Viswabandya et al, 2012). Similar symptoms were reported in two series of 38 cases (Delev et al, 2009; Chapla et al, 2011). Intracranial bleeding occurred in 8% of registry cases and may be a presenting feature of F5D (Salooja et al, 2000; Mathias et al, 2013). Bleeding caused by F5D was more severe in registry cases with FV activity <0·1 iu/ml than in those with FV activity >0·1 iu/ml who were typically asymptomatic or had mild mucocutaneous, surgical bleeding and HMB (Acharya et al, 2004; Delev et al, 2009; Viswabandya et al, 2012). In 50 cases with F5D in the EN-RBD registry, cases with severe bleeding had FV activity 0–0·19 iu/ml and asymptomatic cases had FV activity 0–0·34 iu/ml (Peyvandi et al, 2012b). There are reports of haemarthrosis and intracranial bleeding in cases with FV activity >0·1 iu/ml (Lak et al, 1998; Delev et al, 2009), indicating a poor association between clinical and laboratory phenotypes. Heterozygous F5D carriers have FV activity of 0·2–0·6 iu/ml and are typically asymptomatic (Acharya et al, 2004). F5D manifests as prolongation of the PT and APTT and reduced FV activity determined by one stage PT-based assay. Plasma FV antigen determined by immunoassay is required to distinguish qualitative from quantitative F5D (Murray et al, 1995). FV inhibitors have been reported after FFP treatment in F5D (Salooja et al, 2000; Lee et al, 2001) and after exposure to bovine FV in topical thrombin in cases without F5D (Franchini & Lippi, 2011). Acquired FV deficiency may be distinguished from F5D by PT and APTT mixing studies (Ortel, 1999). As there is currently no FV concentrate, FV replacement with FFP may be required to treat or prevent bleeding in F5D. Pathogen-reduced FFP has been recommended previously for replacement therapy in F5D, although FV activity may be lower than standard FFP (Keeling et al, 2008). SD-FFP (Octaplas LG®; Octapharma, Lachen, Switzerland) has FV activity of 0·7–0·9 iu/ml and less variation than single donor MB-FFP (Table 3). In an open label study of 41 treatment episodes in F5D, SD-FFP 15 ml/kg increased FV activity by 0·15 iu/ml and was effective for the treatment of spontaneous or traumatic bleeds and the prevention of surgical bleeds (Horowitz & Pehta, 1998). The half-life of FV activity after FFP infusion was 16–36 h (Bowie et al, 1967; Thalji & Camire, 2013). Platelet concentrates are an alternative source of FV that have been used previously in combination with SD-FFP when SD-FFP alone was ineffective (Di Paola et al, 2001). Off-label recombinant factor VIIa (rFVIIa) was effective in cases with allergy to FFP (Gonzalez-Boullosa et al, 2005; Coppola et al, 2010), with FV inhibitors (Divanon et al, 2002) or to avoid volume overload (Petros et al, 2008). Symptomatic FV inhibitors in F5D have been neutralized using large volumes of FFP (Di Paola et al, 2001) or intravenous immunoglobulin (Nesheim et al, 1986). Platelet transfusion was effective in acquired FV deficiency not related to F5D (Chediak et al, 1980). A specific FV concentrate (Kedrion Bipharma, Barga, Italy) is currently in clinical development. Intracranial bleeding is reported in neonates with F5D, usually with FV activity <0·1 iu/ml (Mathias et al, 2013). FV activity has a broad range of 0·36–1·08 in healthy term neonates which increases within 1 week (Andrew et al, 1987). Diagnosis of F5D at delivery requires comparison of test results with neonatal reference intervals and confirmation at re-testing at 6 months. Long-term prophylaxis with SD-FFP has been reported in neonates with intracerebral bleeding or FV activity <0·01 iu/ml with FFP 20–30 ml/kg twice weekly (Salooja et al, 2000; Frotscher et al, 2012). FV prophylaxis is practically difficult and may be limited by allergy and fluid overload, particularly in neonates. In cases with severe F5D, it is seldom possible to maintain measurable trough FV activity using SD-FFP. FV activity does not change significantly during normal pregnancy (Stirling et al, 1984), and is usually insufficient for delivery in women with severe F5D. F5D was associated with PPH in an Iranian case series (Lak et al, 1998) and in a review of 25 pregnancies in women with F5D (Noia et al, 1997). Infusions of FFP twice daily for 3 d to maintain FV activity 0·2–0·3 iu/ml and rFVIIa have been reported as effective in preventing bleeding at caesarean delivery in women with F5D (Girolami et al, 2005; Coppola et al, 2010). Factor VII (FVII) deficiency (F7D; MIM #227500) is an autosomal recessive disorder in which reduced plasma FVII activity is caused by quantitative or qualitative defects in the FVII protein. F7D has an estimated worldwide prevalence of one in 500 000 (Mannucci et al, 2004). Approximately 99% of FVII circulates as inactive zymogen and 1% as activated FVII (FVIIa), which binds tissue factor (TF) at sites of blood vessel injury. TF-FVIIa then generates further FVIIa from FVII zymogen and activates FX and FIX to enable low level thrombin generation in the initiation phase of coagulation (Roberts et al, 2006). F7D is caused by rare variations in the F7 gene that encodes FVII (Herrmann et al, 2009). Common variations in the F7 promoter, intron 7 and exon 8 occur in 30% of some populations and influence baseline FVII activity (Bernardi et al, 1997). These may cause clinical and laboratory variability in the phenotype of patients with F7D, but alone, are insufficient to reduce FVII activity to levels associated with bleeding. In 217 symptomatic cases in the Greifswald F7D registry, the most common symptoms were mucocutaneous, soft tissue, joint and gastrointestinal bleeding and HMB. Intracranial bleeding was reported in 1% of symptomatic cases (Bernardi et al, 2009; Herrmann et al, 2009). Similar symptoms were reported in 225 cases with F7D in US, Iranian and Indian registries, although intracranial bleeding was reported in 3–17% (Peyvandi & Mannucci, 1999; Acharya et al, 2004; Viswabandya et al, 2012). Approximately 60% of cases in the US and Greifswald F7D registries were asymptomatic and were identified after an abnormal PT test (Acharya et al, 2004; Herrmann et al, 2009). Reports of venous thrombosis in F7D have uncertain significance (Giansily-Blaizot et al, 2012). Severe bleeding was more likely in registry cases with FVII activity <0·01 iu/ml than those with FVII activity >0·01 iu/ml who typically had mild mucocutaneous bleeding or were asymptomatic (Bernardi et al, 2009; Viswabandya et al, 2012). In 203 cases with F7D in the EN-RBD registry, cases with severe bleeding had FVII activity 0–0·21 iu/ml and asymptomatic cases had

A BLUEPRINT of immune cell development To determine the epigenetic mechanisms that direct blood cells to develop into the many components of our immune system, the BLUEPRINT consortium examined the regulation of DNA and RNA transcription to dissect the molecular traits that govern blood cell differentiation. By inducing immune responses, Saeed et al. document the epigenetic changes in the genome that underlie immune cell differentiation. Cheng et al. demonstrate that trained monocytes are highly dependent on the breakdown of sugars in the presence of oxygen, which allows cells to produce the energy needed to mount an immune response. Chen et al. examine RNA transcripts and find that specific cell lineages use RNA transcripts of different length and composition (isoforms) to form proteins. Together, the studies reveal how epigenetic effects can drive the development of blood cells involved in the immune system. Science , this issue 10.1126/science.1251086 , 10.1126/science.1250684 , 10.1126/science.1251033

The guideline writing group was selected to be representative of UK-based medical experts. The MEDLINE and EMBASE databases were searched systematically for publications in English from 1966 to June 2011 and 1980 to June 2011 respectively, using the following strategy: Approved and proprietary names of the antithrombotic agents described in the guideline were combined with terms relating to antidote, reversal, haemorrhage, (activated) prothrombin complex concentrate, factor VIII inhibitor bypass activity (FEIBA), Beriplex, Octaplex, recombinant activated factor VII (rFVIIa), Novoseven, fresh frozen plasma, tranexamic acid, antifibrinolytic, platelet transfusion, and desmopressin. Identified papers were also searched for additional references. The writing group produced the draft guideline which was subsequently revised by consensus by members of the Haemostasis and Thrombosis task Force of the British Committee for Standards in Haematology (BCSH). The guideline was then reviewed by a sounding board of approximately 50 UK haematologists, the BCSH and the British Society for Haematology Committee and comments incorporated where appropriate. Criteria used to quote levels and grades of evidence are as outlined in: http://www.bcshguidelines.com/BCSH_PROCESS/EVIDENCE_LEVELS_AND_GRADES_OF_RECOMMENDATION/43_GRADE.html. The objective of this document is to guide healthcare professionals on the management of patients receiving antithrombotic drugs who experience significant bleeding or who require emergency surgery or an invasive procedure. Guidance on reversal of vitamin K antagonists (VKAs; warfarin, phenprocoumon, acenocoumarol (sinthrome) and phenindione has been described previously (Keeling et al, 2011). Antithrombotic drugs are used increasingly in patient groups at greater bleeding risk. Although major haemorrhage is infrequent, management can be difficult especially with antithrombotics for which there are no specific reversal agents. Bleeding during antithrombotic therapy is associated with high morbidity and mortality (Linkins et al, 2003; Eikelboom et al, 2006; Mannucci & Levi, 2007). Before any antithrombotic treatment is started, the risks and benefits should be carefully considered. In this guideline we consider the management of bleeding in patients on the more widely used antithrombotic agents including heparin, anti-IIa and anti-Xa inhibitors, oral VKAs, anti-platelet drugs as well as the fibrinolytic agents. In many cases, simple non-pharmacological measures and stabilization of the patient whist the antithrombotic is eliminated are sufficient to treat or prevent bleeding (Table 1). Plasmapheresis or haemofiltration may rapidly reduce the plasma concentration of antithrombotic drugs that are not highly protein bound. However, these techniques are often inaccessible in emergency settings outside highly specialized units. Specific antidotes are not always available to reverse antithrombotic drugs in emergencies. However, general pro-haemostatic agents, listed in Table 2 may be useful in some circumstances. Recombinant activated factor VII (rFVIIa, Novoseven®), prothrombin complex concentrates (PCC) and activated PCC [APCC; e.g. factor VIII inhibitor bypass activity (FEIBA)] are often considered as agents for reversal of the effect of antithrombotic drugs. However, off-label use of rFVIIa for critical bleeding was associated with arterial thrombosis in 5·5% vs. 3·2% in placebo in all patient groups and 10·8% vs. 4·1% in placebo in patients >75 years (Levi et al, 2010). Efficacy of rFVIIa as a reversal agent has been demonstrated in vitro, in animal studies and single case reports, which are subject to publication bias. Reversal of the effect of anti-thrombotics is an unlicensed indication for rFVIIa (Sorour et al, 2010) but this agent is often considered as a last resort when all other measures have failed and the risks and benefits are carefully documented. With the exception of the use of PCC to reverse warfarin and other VKAs, there is little evidence supporting the use of PCC and APCC as correction agents for other antithrombotics. PCC and APCC agents may increase thrombosis risk although this has not been evaluated in large-scale meta-analyses. PCC and APCC may be considered in settings of critical or refractory bleeding after thrombosis risk has been considered. The use of rFVIIa, PCC and APCC will be discussed in more detail in subsequent sections. Fresh frozen plasma (FFP) may be a suitable reversal agent for warfarin or other VKA (if PCC is unavailable) and as a source of clotting factors in major haemorrhage. However, FFP has no proven efficacy as a reversal agent for antithrombotics other than warfarin, even those that cause prolonged prothrombin (PT) or activated partial thromboplastin (APTT) times by inhibiting coagulation factors (Crowther & Warkentin, 2009). In the following sections, individual antithrombotics and options for reversal of the anticoagulant effect are discussed. With the exception of VKAs and unfractionated heparin (UFH), the evidence for individual approaches is often weak and limited to small case series and case reports. For some antithrombotics, clinical evidence to guide correction of the anticoagulant effect is absent and recommendations are based on theoretical considerations and animal studies. The characteristics, monitoring and mechanisms of action of UFH were recently reviewed (Gray et al, 2008). At therapeutic intravenous (IV) doses, the plasma half-life of UFH is 45–90 min because of rapid cellular elimination. However, at higher doses, this mechanism becomes saturated and renal clearance results in a longer half-life (Hirsh et al, 2008). The pharmacokinetic clearance of UFH and pharmacodynamic effect varies between patients due to differences in plasma protein binding. UFH activity may be monitored with the APTT, activated clotting time (ACT) or thromboelastometric assays. Given the short plasma half-life of UFH, treatment or prevention of bleeding can often be achieved by stopping UFH and general measures. UFH can be rapidly reversed with protamine sulphate, which is derived from fish sperm and forms a stable, inactive salt with heparin. Protamine dose may be calculated from the quantity of UFH administered in the 2 h prior to reversal using the assumption that 1 mg protamine neutralizes 80–100 units of UFH. For example, bleeding during an IV infusion of UFH 1250 units/h requires 25 mg protamine. Bleeding soon after a bolus dose of 5000 units requires 50 mg (Hirsh et al, 2008). The half-life of protamine is 7 min, which is shorter than UFH, thus, prolonged protamine administration may be necessary if UFH has been administered subcutaneously, causing entry into the circulation to be delayed (Hirsh et al, 2008). The reversal effect of protamine can be monitored by the APTT. Protamine can cause severe allergic reactions including anaphylaxis, hypotension, bronchospasm and skin reactions in up to 10% of patients. Risk factors are previous exposure to protamine sulphate (including protamine-containing insulin preparations), rate of administration, vasectomy and fish allergy (Porsche & Brenner, 1999). Protamine sulphate should be given slowly over >5 min (Crowther & Warkentin, 2008). Patients at risk may be pre-treated with corticosteroids and antihistamines. At higher doses, protamine may have significant anticoagulant and antiplatelet effects (Ammar & Fisher, 1997; Ni Ainle et al, 2009). Low molecular weight heparins (LMWH) are derived from UFH through chemical or enzymatic depolymerization. The ratios of anti-Xa to anti-IIa activities vary between products depending on LMWH chain length. However the half-life of the anticoagulant activity of LMWH lasts approximately 4 h. The mechanism of action of LMWH and differences from UFH were recently reviewed (Gray et al, 2008). LMWH activity may be monitored with the anti-Xa test. Although LMWH may also prolong the APTT, this test should not be used to assess the extent of drug effect. Protamine reverses approximately 60% of LMWH based on data from animal studies (Bang et al, 1991; Lindblad et al, 1987; Van Ryn-McKenna et al, 1990) and healthy human volunteers (Holst et al, 1994). The largest study using protamine in patients (Van Veen et al, 2011) described three patients requiring emergency surgery and 14 patients that were actively bleeding whilst receiving LMWH and who received protamine at doses suggested by the ACCP guidelines (Hirsh et al, 2008). Protamine prevented excessive bleeding in all the surgical patients and was effective in eight of 12 evaluable patients with active bleeding. Anti-Xa levels after protamine sulphate administration did not correlate with the likelihood of persistent bleeding (Van Veen et al, 2011). Animal studies using rFVIIa for LMWH reversal show contradictory results (Chan et al, 2003; Lauritzen et al, 2008). Registry data indicate the successful use of rFVIIa in six patients with significant bleeding (Ingerslev et al, 2007), two of whom also received PCC but none of whom received protamine. Doses of rFVIIa varied between 20 and 120 μg/kg. Danaparoid is a heparinoid consisting of a mixture of glycosaminoglycans with an anti-Xa/anti-IIa ratio > 20 (Hirsh, 1992). Danaparoid is excreted renally and has a plasma half-life of anti-Xa activity of approximately 24 h (Danhof et al, 1992). Danaparoid may be monitored by anti-Xa assay using a danaparoid standard. Major bleeding occurred in 8·1% of patients treated with danaparoid for heparin-induced thrombocytopenia (HIT) (Magnani & Gallus, 2006). Continued bleeding after cardiopulmonary bypass surgery (CPB) on danaparoid has been reported despite intensive blood product replacement (Schmahl et al, 1997; Westphal et al, 1997; Gitlin et al, 1998; Fernandes et al, 2000; Pamboukian et al, 2000). There is no specific antidote for danaparoid. However, plasmapheresis removes danaparoid effectively from the circulation (Schmahl et al, 1997). An ex vivo study showed partial restoration of thrombin generation when rFVIIa was added at supra-therapeutic doses to plasma spiked with danaparoid, but not with addition of APCC and FFP (Gatt et al, 2008). Fondaparinux is a synthetic pentasaccharide with indirect anti-Xa activity that achieves steady state antithrombotic activity after 3–4 d of use. The plasma half-life is 17–20 h with normal renal function and up to 72 h when creatinine clearance is <30 ml/min (Donat et al, 2002; Samama & Gerotziafas, 2003). There is no specific antidote for fondaparinux. In vitro and ex vivo studies suggest that rFVIIa may enable at least partial correction as determined by global coagulation assays (Gatt et al, 2008; Desmurs-Clavel et al, 2009). A placebo controlled study in healthy volunteers treated with therapeutic doses of fondaparinux and 90 μg/kg rFVIIa demonstrated correction of prolonged coagulation times and partial restoration of thrombin generation (Bijsterveld et al, 2002). Partial clinical efficacy of rFVIIa has been demonstrated in small case series (Dao et al, 2005; Huvers et al, 2005; Luporsi et al, 2011). Bivalirudin is a recombinant peptide thrombin inhibitor and is the only licensed hirudin in the UK. The lepirudin licence was recently withdrawn and so it is not considered in this guideline. Bivalirudin is cleared predominantly through proteolysis by thrombin (80%) and only 20% is excreted renally. The half-life is approximately 25 min, 1 h in severe renal impairment and 3·5 h in dialysis-dependent patients (Chew, 2002). Bivalirudin activity may be monitored by ACT or by APTT. The PT is minimally prolonged at therapeutic bivalirudin concentrations. The pharmacology and clinical applications of bivalirudin have been reviewed recently (Warkentin et al, 2008). Given the short plasma half-life of bivalirudin, cessation of treatment and general haemostatic measures are often sufficient for correction of the effect except when there is prolonged clearance due to renal impairment. An in vivo study showed that modified ultrafiltration after CPB surgery in patients with normal renal function reduced the half-life by 20% and reduced postoperative blood loss (Koster et al, 2008). Argatroban is a reversible direct thrombin inhibitor that is rapidly eliminated via the hepatic cytochrome P450 3A4/5 enzyme. The plasma half-life is 45 min. Argatroban is usually monitored by APTT ratio. However, argatroban also prolongs the PT, ACT and thrombin time. There is no specific antidote for argatroban but given its short half-life, stopping the drug enables correction of the anticoagulation effect in most cases. Severe bleeding related to reduced elimination of argatroban after cardiac surgery was reported to be unresponsive to blood component treatments alone (Edwards et al, 2003; Gasparovic et al, 2004) and blood components in combination with rFVIIa (Malherbe et al, 2004; Genzen et al, 2010). Treatment with rFVIIa ex vivo restored abnormal thromboelastography parameters in blood samples from two patients treated with argatroban (Young et al, 2007). However, in an animal study of a different direct thrombin inhibitor (melagatran), rFVIIa had no effect on bleeding time whereas APCC reduced bleeding time (Elg et al, 2001). With yet another direct thrombin inhibitor, dabigatran, the drugs rVIIa, APCC and PCC exhibited activity in correcting the coagulopathy in animal models (Van Ryn et al, 2010a; Van Ryn et al, 2008). There are no data on the use of APCC in bleeding during argatroban treatment. Guidelines for the management of patients on warfarin experiencing major or non-major bleeding or over-anticoagulation were included in a recent BCSH guideline on oral anticoagulation with warfarin (Keeling et al, 2011). For completeness, these recommendations have been included below. Whilst warfarin is the main coumarin used in the UK and North America, the VKA drugs phenprocoumon, acenocoumarol (sinthrome) and phenindione are also available and widely used in some countries. All drugs in this class reduce functional levels of the vitamin K-dependent clotting factors (II, VII, IX and X) but have different effective half-lives. Following discontinuation of treatment, the anticoagulant effect of phenprocoumon lasts the longest, and acenocoumarol the shortest. The principles of reversal of the anticoagulant effect with vitamin K and PCC are the same as for warfarin. However, further administration of vitamin K should be considered for correction of VKAs with longer half-lives. The pro-drug dabigatran etexilate is rapidly hydrolysed to the active form dabigatran, a direct thrombin inhibitor. Following oral administration, plasma levels peak within 2–3 h. In individuals with normal renal function, the half-life is 13 h (range 11–22 h; van Ryn et al, 2010b). Dabigatran is 80% eliminated by the kidneys and has a prolonged plasma half-life in patients with renal impairment (plasma half-life 22–35 h with creatinine clearance < 30 ml/min). It is used for surgical thromboprophylaxis at a dose of 150–220 mg once daily and for stroke prevention in atrial fibrillation (AF) at a dose of 110 or 150 mg twice daily. In the Randomized Evaluation of Long-Term Anticoagulation Therapy (RE-LY) trial of dabigatran in atrial fibrillation the annual risk of major bleeding was 2·71% and 3·11% with the 110 and 150 mg dabigatran doses, respectively, in comparison to 3·36% for patients treated with warfarin (Connolly et al, 2009). It must be appreciated, however, that both these figures are conservative as this pivotal trial excluded many real-life situations of patients with extreme body weights, significant renal impairment or multiple co-morbidities. A major advantage of dabigatran is that its use does not involve monitoring its concentration or effect but this is also a disadvantage because in a bleeding patient it is difficult to be sure of its concentration due to variable effect on the different standard coagulation tests (van Ryn et al, 2010b). A normal thrombin time and a normal APTT imply that a high level of dabigatran is unlikely in the patient. There are no published clinical trials or other high quality evidence addressing the management of bleeding on dabigatran. Van Ryn et al (2009) showed in vitro that activated charcoal was able to bind virtually all the dabigatran etexilate and dabigatran suspended in water, and it would be reasonable to recommend that activated charcoal is given orally to bleeding patients if they have had a dose of the drug within 2 h to prevent further absorption (van Ryn et al, 2010b). In view of the relatively short dabigatran half-life, minor bleeding should be managed by withholding further doses of the drug and using standard measures, such as direct pressure, simple surgical intervention and fluid replacement. In an emergency, dabigatran plasma clearance would be expected to be accelerated using haemodialysis or haemofiltration because it has relatively low plasma protein binding at 35%. Supportive evidence is provided by the fact that haemodialysis effectively reduces the plasma level of dabigatran in patients with end stage renal disease (Stangier et al, 2010; van Ryn et al, 2010b). Van Ryn et al (2010c) also showed that charcoal haemoperfusion using the commercially available Gambro Adsorba Cartridge (containing activated carbon in the form of charcoal) was able to remove c. 85% of dabigatran suspended in bovine blood and circulating in an in vitro system. Only very limited reports on the use of these techniques in bleeding patients on dabigatran are available and the evidence for their support remains preliminary (Warkentin et al, 2012). Furthermore, their rapid deployment in settings outside intensive care units is likely to be challenging. No antidote is available for use in patients with major or life-threatening bleeding on dabigatran. In the absence of this, rFVIIa, PCC and APCC have been investigated in vitro, ex vivo and in animal models. In a rat tail bleeding time model, rFVIIa and FEIBA (Van Ryn et al, 2008), and in a rabbit trauma model Beriplex (a four-factor PCC) were effective in correcting the coagulopathy (Van Ryn et al, 2010a). In an in vitro experiment using the calibrated automated thrombogram, rFVIIa failed to correct the suppressed thrombin generation induced by dabigatran in spiked platelet-rich plasma samples (Perzborn & Harwardt, 2007). In experiments on healthy volunteers, rFVIIa failed to correct the reduced thrombin generation of melagatran, another direct thrombin inhibitor (Wolzt et al, 2004), and more recently this failure was also observed with a PCC (Eerenberg et al, 2011; Levi et al, 2011). At present the data on rFVIIa and APCC is preliminary and inconclusive and not based on bleeding humans, nevertheless until new knowledge becomes available it is reasonable to try these products in patients with life-threatening bleeding on dabigatran, having made a risk-benefit decision on an individual basis. A number of direct oral factor Xa inhibitors are in development but so far only two have been licensed for thromboprophylaxis and/or treatment of venous thromboembolism and stroke prevention in AF. Following an oral dose, both rivaroxaban and apixaban reach a peak at 3 h and have half-lives of 7–9 and 9–14 h respectively, in patients with normal renal function. In both cases, 75% are metabolized by the liver and 25% are excreted unchanged by the kidneys. In the ROCKET AF (Rivaroxaban Once Daily Oral Direct Factor Xa Inhibition Compared with Vitamin K Antagonism for Prevention of Stroke and Embolism Trial in Atrial Fibrillation) trial, the annual risk of major bleeding was 3·6% for 20 mg once daily rivaroxaban and 3·4% for warfarin (Patel et al, 2011). In the ARISTOTLE (Apixaban for Reduction in Stroke and Other Thromboembolic Events in Atrial Fibrillation) trial, which compared apixaban 5 mg twice daily with warfarin in AF, the annual risks of major bleeding were 2·13% and 3·09%, respectively (Granger et al, 2011). As these clinical trials restricted recruitment of some patient groups, such as at the extreme of body weight, significant renal impairment and multiple comorbidities, the real risk of bleeding experienced in clinical practice is likely to be higher. As these drugs show high plasma protein binding they would not be expected to be dialysable. For minor bleeding, in view of the short half-life, supportive measures, such as direct pressure, minor surgical intervention and fluid replacement, should be tried. No antidote is available for use in patients with major or life-threatening bleeding on rivaroxaban or apixaban. In the absence of this, rFVIIa and PCC have been investigated in vitro, ex vivo, and in animal models. In an in vitro study using the calibrated thrombogram with platelet-rich plasma spiked with rivaroxaban, the suppressed thrombin generation could be partially reversed with rFVIIa (Perzborn & Harwardt, 2007). In a different in vitro system using spiked whole blood and employing rotational thromboelastometry (ROTEM), only a modest correction was obtained following the addition of rFVIIa or PCC to the samples (Olesen et al, 2009). In a baboon animal model the effects of rivaroxaban on the bleeding time and coagulation tests could be partially reversed with both rFVIIa and the APCC (Gruber et al, 2008). In a rabbit model both PCC and rFVIIa were able to partially improve the laboratory parameters but did not reverse rivaroxaban-induced bleeding (Godier et al, 2012). In a controlled clinical trial in healthy volunteers, PCC was able to correct the prolonged prothrombin time and restore the suppressed thrombin generation induced by rivaroxaban (Eerenberg et al, 2011; Levi et al, 2011). Although so far most of the available data regarding reversal of effect are for rivaroxaban, in view of the common mode of action, similar results would be expected for apixaban but this remains to be proven. In an in vitro study of fibrin permeability and fibrin network structure, FEIBA® was able to only partially correct the defect induced by apixaban (Blomback et al, 2011). In the absence of an antidote, based on animal studies results, PCC, rFVIIa and APCC may be tried after carefully balancing the risks and benefits associated with the use of these products. Anti-platelet drugs have short plasma half-lives but may have a prolonged biological effect because of irreversible platelet inhibition (Table 3). As there are no specific reversal agents, the treatment or prevention of bleeding requires general haemostatic measures, cessation of anti-platelet treatment or reversal of the effect of co-prescribed antithrombotics. However, many patients who are prescribed anti-platelet drugs are at high risk of arterial thrombosis. Therefore the safety of anti-thrombotic drug withdrawal and pro-haemostatic interventions should be considered carefully through a multi-disciplinary risk assessment. If anti-platelet agents are withdrawn they should be re-instated as soon as possible after haemostasis is secured (Howard-Alpe et al, 2007; Bhala et al, 2011; Korte et al, 2011). Platelet transfusion may be considered for emergency reversal of the anti-platelet effect but may confer a risk of arterial thrombosis. Aspirin inhibits platelet activation by inactivating platelet cyclooxygenase. Aspirin has a rapid onset of action after oral administration (<1 h but 3–4 h with enteric-coated preparations) and has a plasma half-life of c. 20 min. However, laboratory evidence of platelet inhibition may persist for 4 d because the effects of aspirin on individual platelets is irreversible (Li et al, 2012). Aspirin increases the risk of surgical bleeding 1·5-fold, but does not increase the severity of bleeding for most procedures. Given that 10% of acute cardiovascular events are preceded by aspirin withdrawal and the average time interval from withdrawal to acute stroke and acute coronary syndrome are 14·3 and 8·5 d respectively, aspirin is not usually withdrawn before surgery (Burger et al, 2005). Several studies have demonstrated a lack of haematoma following neuroaxial anaesthesia while on low dose aspirin (Horlocker et al, 2003; Burger et al, 2005). Desmopressin reduced the bleeding time in healthy aspirin-treated volunteers (Mannucci et al, 1986). However, desmopressin is relatively contraindicated in patients with cardiovascular disease and there is no evidence to support efficacy in this patient group. Similarly, rFVIIa reverses abnormal thrombin generation in platelet-rich plasma from aspirin-treated volunteers (Altman et al, 2006) but this agent has not been studied systematically in patients receiving aspirin. Mixing aspirin-treated platelets ex vivo with 30–50% untreated donor platelets restored abnormal platelet aggregation responses (Vilahur et al, 2007; Li et al, 2012). In practice, infusion of 2–3 adult doses of donor platelets is usually effective for emergency reversal of the effect of aspirin in adults. There are no specific reversal agents for aspirin. The P2Y12 antagonists include the pro-drugs clopidogrel and prasugrel and the active drug ticagrelor. Clopidogrel may show a delayed onset of platelet inhibition of 4–8 h because it requires activation by two-stage hepatic metabolism. Prasugrel, which requires one-stage activation, and ticagrelor exert anti-platelet effect within 2–4 h. The active metabolites of clopidogrel and prasugrel have short plasma half-lives (c. 0·5 and c. 7 h respectively), although as they are irreversible P2Y12 antagonists, the duration of platelet inhibition may be 5–7 d (Weber et al, 2001; Price et al, 2011) or longer (Li et al, 2012). Ticagrelor is a potent P2Y12 antagonist that has a plasma half-life of 8–12 h and is more reversible than clopidogrel and prasugrel. However, the anti-platelet effect of ticagrelor may persist for 3–5 d (Nawarskas & Snowden, 2011). All the P2Y12 antagonists are eliminated by hepatic inactivation (Giorgi et al, 2011). Desmopressin shortened the bleeding time in healthy volunteers after exposure to clopidogrel (Mannucci et al, 1986; Leithauser et al, 2008) but safety concerns in patients with cardiovascular disease usually prevent use. Mixing platelets treated with P2Y12 antagonists ex vivo with untreated donor platelets restored abnormal platelet aggregation responses although a higher proportion of donor platelets was required than for correction of the aspirin effect (Vilahur et al, 2007; Li et al, 2012). The efficacy of platelet transfusion may be reduced in patients who have recently ingested clopidogrel. There are no specific reversal agents for the P2Y12 antagonists. Glycoprotein (GP) IIb/IIIa inhibitors are parenteral drugs that prevent fibrinogen- mediated platelet aggregation and are usually administered with other anti-platelet drugs and parenteral anticoagulants to patients with acute coronary syndrome as an adjunct to percutaneous coronary intervention (PCI). In a meta-analysis of six pivotal randomized controlled clinical trials, the risk of major bleeding associated with GPIIb/IIIa antagonists (co-prescribed with other antithrombotics) was 2·4% compared to 1·4% in placebo or control groups (Boersma et al, 2002). Abciximab is a monoclonal anti-GPIIb/IIIa antibody that has a rapid onset of action and a plasma half-life of c. 30 min. Abciximab is eliminated from plasma by rapid binding to platelets but platelets may remain inhibited for 12–24 h because of persistent binding to the GPIIb/IIIa fibrinogen receptor (Tcheng et al, 1994). Moderate thrombocytopenia (<50 × 109/l) was reported in 2·5–5·2% and severe thrombocytopenia (<20 × 109/l) in 0·3–0·5% of patients receiving abciximab and may develop within 2–4 h of the start of infusion (Madan & Berkowitz, 1999); (Berkowitz et al, 1997). Thrombocytopenia typically resolves within 4–7 d of cessation of abciximab but carries high bleeding risk. Platelet transfusion is effective for thrombocytopenic bleeding after abciximab and has been proposed as a prophylactic measure for thrombocytopenia <10 × 109/l (Madan & Berkowitz, 1999). Re-exposure to abciximab is associated with severe thrombocytopenia in 2·4% of recipients (Tcheng et al, 2001). Tirofiban and eptifibatide are fully reversible blockers of the fibrinogen binding site on GPIIb/IIIa that have rapid onset of action and short plasma half-lives (tirofiban c. 1·5 h; eptifibatide c. 2·5 h). Both agents are eliminated by the kidneys (tirofiban c. 66% renal clearance; eptifibatide c. 50%) and confer increased bleeding risk in patients with renal impairment (Smith & Gandhi, 2001). However, in the absence of renal impairment, the bleeding risk diminishes rapidly after cessation of treatment (Peerlinck et al, 1993). Thombocytopenia is uncommon in patients receiving tirofiban and eptifibatide and a causal association has not been proven (Madan & Berkowitz, 1999). The fibrinolytic agents currently licensed in the UK are: alteplase, tenecteplase, reteplase, urokinase and streptokinase. All five agents function indirectly by promoting generation of plasmin, which then mediates clot lysis. Alteplase is recombinant native-type tissue plasminogen activator (tPA) with a plasma half-life of 4–8 min. It is cleared mainly by metabolism in the liver. Tenecteplase is a recombinant modified form of tPA with six amino acid substitutions causing increased half-life of c. 20 min, increased resistance to PAI-1 inhibition and increased fibrin specificity (Melandri et al, 2009). It is cleared mainly by metabolism in the liver. Reteplase is a recombinant truncated form of tPA (Simpson et al, 2006; Van de Werf, 1999). Reteplase is less specific to fibrin than tPA and thus, causes a greater systemic reduction in fibrinogen. The initial half-life is c. 15 min and it is cleared via kidney and liver. Streptokinase binds plasminogen, forcing it into an active configuration to activate other free plasminogen molecules. It therefore lacks fibrin specificity and produces greater reduction in plasma fibrinogen. Peak fibrinolytic activity occurs about 20 min after administration and the plasma half-life of the drug is 23–39 min. However, the half-life of the antithrombotic effect of streptokinase is about 80 min. Urokinase is a direct plasminogen activator and has partial fibrin specificity. It is eliminated rapidly from the circulation by metabolism in the liver with a half-life of 20 min. Elimination is delayed in patients with liver disease and impaired kidney function. Bleeding after treatment with fibrinolytic drugs may arise through several mechanisms including plasmin-mediated lysis of fibrin clot and antiplatelet actions (Benedict et al, 1995; Moser et al, 1999; Serebruany et al, 2003; Gurbel et al, 2005). The fibrinolytics also reduce plasma concentrations of antiplasmin leading to plasminaemia and depletion of fibrinogen and other clotting factors, notably factor V (Tracy et al, 1997; Stangl et al, 1998). The magnitude of fibrinogen and factor V reduction does not correlate with the frequency of intracerebral haemorrhage (ICH) during treatment with fibrinolytic drugs (Tracy et al, 1997; Stewart et al, 2003). Although the half-lives of the fibrinolytic drugs are themselves relatively short, their effect on coagulation parameters is much longer. After alteplase for stroke or myocardial infarction (MI), fibrinogen was lowest at 2–3 h, remained low at 24 h and returned to normal at 48 h (Stangl et al, 1998; Szabo et al, 2002; Tanne et al, 2006). A similar pattern was seen with reteplase (Hoffmeister et al, 2000). The factor V nadir occurs at approximately 1 h (Tracy et al, 1997). Goldstein et al (2010) reported on 20/352 patients who developed ICH after thrombolytic therapy for stroke. None had fibrinogen < 1 g/l and only 11 received therapy, which included FFP, cryoprecipitate, vitamin K, platelets and aminocaproic acid. However, it is impossible to assess the benefit of these measures due to the very small numbers in each group. There are no clinical data regarding the efficacy of any measure to reverse fibrinolytic drugs in vivo. Recommendations are derived from expert opinion, and are consistent with previously published guidelines (Broderick et al, 2007; Uchino et al, 2011) and opinion (Wechsler, 2011). For major bleeding (e.g. intracerebral) within 48 h of administration we recommend:

Heteroplasmy incidence in mitochondrial DNA In humans, mitochondrial DNA (mtDNA) is predominantly maternally inherited. mtDNA is under selection to prevent heteroplasmy—the transmission of multiple genetic variants into the next generation. Wei et al. explored human mtDNA sequences to determine mtDNA genome structure, selection, and transmission. Whole-genome sequencing revealed that about 45% of individuals carry heteroplasmic mtDNA sequences at levels greater than 1% of their total mtDNA. Furthermore, studies of more than 1500 mother-offspring pairs indicated that the female line selected which mtDNA variants were passed on to children. This effect was influenced by the mother's nuclear genetic background. Thus, mtDNA is under selection at specific loci in the human germ line. Science , this issue p. eaau6520

Abstract The genetic etiologies of more than half of rare diseases remain unknown. Standardized genome sequencing and phenotyping of large patient cohorts provide an opportunity for discovering the unknown etiologies, but this depends on efficient and powerful analytical methods. We built a compact database, the ‘Rareservoir’, containing the rare variant genotypes and phenotypes of 77,539 participants sequenced by the 100,000 Genomes Project. We then used the Bayesian genetic association method BeviMed to infer associations between genes and each of 269 rare disease classes assigned by clinicians to the participants. We identified 241 known and 19 previously unidentified associations. We validated associations with ERG , PMEPA1 and GPR156 by searching for pedigrees in other cohorts and using bioinformatic and experimental approaches. We provide evidence that (1) loss-of-function variants in the Erythroblast Transformation Specific (ETS)-family transcription factor encoding gene ERG lead to primary lymphoedema, (2) truncating variants in the last exon of transforming growth factor-β regulator PMEPA1 result in Loeys–Dietz syndrome and (3) loss-of-function variants in GPR156 give rise to recessive congenital hearing impairment. The Rareservoir provides a lightweight, flexible and portable system for synthesizing the genetic and phenotypic data required to study rare disease cohorts with tens of thousands of participants.

ABSTRACT Background Repeat expansion (RE) disorders affect ~1 in 3000 individuals and are clinically heterogeneous diseases caused by expansions of short tandem DNA repeats. Genetic testing is often locus-specific, resulting in under diagnosis of atypical clinical presentations, especially in paediatric patients without a prior positive family history. Whole genome sequencing (WGS) is emerging as a first-line test for rare genetic disorders, but until recently REs were thought to be undetectable by this approach. Methods WGS pipelines for RE disorder detection were deployed by the 100,000 Genomes Project and Illumina Clinical Services Laboratory. Performance was retrospectively assessed across the 13 most common neurological RE loci using 793 samples with prior orthogonal testing (182 with expanded alleles and 611 with alleles within normal size) and prospectively interrogated in 13,331 patients with suspected genetic neurological disorders. Findings WGS RE detection showed minimum 97·3% sensitivity and 99·6% specificity across all 13 disease-associated loci. Applying the pipeline to patients from the 100,000 Genomes Project identified pathogenic repeat expansions which were confirmed in 69 patients, including seven paediatric patients with no reported family history of RE disorders, with a 0.09% false positive rate. Interpretation We show here for the first time that WGS enables the detection of causative repeat expansions with high sensitivity and specificity, and that it can be used to resolve previously undiagnosed neurological disorders. This includes children with no prior suspicion of a RE disorder. These findings are leading to diagnostic implementation of this analytical pipeline in the NHS Genomic Medicine Centres in England. Funding Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research, Illumina Inc