In double-membraned bacteria, phospholipids must be transported across the cell envelope to maintain the outer membrane barrier, which plays a key role in antibiotic resistance and pathogen virulence. The Mla system has been implicated in phospholipid trafficking and outer membrane integrity, and includes an ABC transporter complex, MlaFEDB. The transmembrane subunit, MlaE, has minimal sequence similarity to other ABC transporters, and the structure of the entire inner membrane MlaFEDB complex remains unknown. Here we report the cryo-EM structure of the MlaFEDB complex at 3.05 Å resolution. Our structure reveals that while MlaE has many distinct features, it is distantly related to the LPS and MacAB transporters, as well as the eukaryotic ABCA/ABCG families. MlaE adopts an outward-open conformation, resulting in a continuous pathway for phospholipid transport from the MlaE substrate-binding site to the pore formed by the ring of MlaD. Unexpectedly, two phospholipids are bound in the substrate-binding pocket of MlaFEDB, raising the possibility that multiple lipid substrates may be translocated each transport cycle. Site-specific crosslinking confirms that lipids bind in this pocket in vivo . Our structure provides mechanistic insight into substrate recognition and transport by the MlaFEDB complex.

ABC transporters facilitate the movement of a diverse array of molecules across cellular membranes, using power from ATP hydrolysis. While the overall mechanism of the transport cycle has been characterized in detail for several important members of this transporter family, it is less well understood how the activity of ABC transporters is regulated in the cell post-translationally. Here we report the X-ray crystal structure of MlaFB from E. coli , an ABC nucleotide binding domain (MlaF) in complex with its putative regulatory subunit (MlaB). MlaFB constitutes the cytoplasmic portion of the larger MlaFEDB ABC transporter complex, which drives phospholipid transport across the bacterial envelope and is important for maintaining the integrity of the outer membrane barrier. Our data show that the regulatory subunit MlaB, a STAS domain protein, binds to the nucleotide binding domain and is required for its stability. Our structure also implicates a unique C-terminal tail of the ABC subunit, MlaF, in self-dimerization. Both the C-terminal tail of MlaF and the interaction with MlaB are required for the proper assembly of the MlaFEDB complex and its function in cells. This work leads to a new model for how the activity of an important bacterial lipid transporter may be regulated by small binding proteins, and raises the possibility that similar regulatory mechanisms may exist more broadly across the ABC transporter family, from bacteria to humans.

The outer membrane of Gram-negative bacteria provides a formidable barrier, essential for both pathogenesis and antimicrobial resistance. Biogenesis of this complex structure necessitates the transport of phospholipids across the cell envelope. Recently, YhdP was implicated as a major protagonist in the trafficking of inner membrane phospholipids to the outer membrane; however the molecular mechanism of YhdP mediated transport remains elusive. Here, utilising AlphaFold, we observe YhdP to form an elongated assembly of 60 β-strands that curve to form a continuous hydrophobic groove. This architecture is consistent with our negative stain electron microscopy data which reveals YhdP to be approximately 250 Å in length and thus sufficient to span the bacterial cell envelope. Furthermore, molecular dynamics simulations and bacterial growth assays indicate essential helical regions at the N- and C-termini of YhdP, that may embed into the inner and outer membranes respectively, reinforcing its envelope spanning nature. Our in vivo crosslinking data reveal phosphate-containing substrates captured along the length of the YhdP groove, providing direct evidence that YhdP interacts with a phosphate-containing substrate, which we propose to be phospholipids. This finding is congruent with our molecular dynamics simulations which demonstrate the propensity for inner membrane lipids to spontaneously enter the groove of YhdP. Collectively, our results support a model in which YhdP bridges the cell envelope, providing a hydrophobic environment for the transport of phospholipids to the outer membrane.

Abstract The cell envelope is essential for viability in all kingdoms of life. It retains enzymes and substrates within a confined space while providing a protective barrier to the external environment. Destabilising the envelope of bacterial pathogens is a common strategy employed by antimicrobial treatment. However, even in one of the most well studied organisms, Escherichia coli , there remain gaps in our understanding of how the synthesis of the successive layers of the cell envelope are coordinated during growth and cell division. Here, we used a whole genome phenotypic screen to identify mutants with a defective cell envelope. We report that loss of yhcB , a conserved gene of unknown function, results in loss of envelope stability, increased cell permeability and dysregulated control of cell size. Using whole genome transposon mutagenesis strategies we report the complete genetic interaction network of yhcB , revealing all genes with a synthetic negative and a synthetic positive relationship. These genes include those previously reported to have a role in cell envelope biogenesis. Surprisingly, we identified genes previously annotated as essential that became non-essential in a Δ yhcB background. Subsequent analyses suggest that YhcB sits at the junction of several envelope biosynthetic pathways coordinating the spatiotemporal growth of the cell, highlighting YhcB as an as yet unexplored antimicrobial target.

Bacterial proteins with MCE domains were first described as being important for Mammalian Cell Entry. More recent evidence suggests they are components of lipid ABC transporters. In Escherichia coli, the single-domain protein MlaD is known to be part of an inner membrane transporter that is important for maintenance of outer membrane lipid asymmetry. Here we describe two multi MCE domain-containing proteins in Escherichia coli, PqiB and YebT, the latter of which is an orthologue of MAM-7 that was previously reported to be an outer membrane protein. We show that all three MCE domain-containing proteins localise to the inner membrane. Bioinformatic analyses revealed that MCE domains are widely distributed across bacterial phyla but multi MCE domain-containing proteins evolved in Proteobacteria from single-domain proteins. Mutants defective in mlaD, pqiAB and yebST were shown to have distinct but partially overlapping phenotypes, but the primary functions of PqiB and YebT differ from MlaD. Complementing our previous findings that all three proteins bind phospholipids, results presented here indicate that multi-domain proteins evolved in Proteobacteria for specific functions in maintaining cell envelope homeostasis.

Gram-negative bacteria are surrounded by an outer membrane composed of phospholipids and lipopolysaccharide (LPS), which acts as a barrier to the environment and contributes to antibiotic resistance. While mechanisms of LPS transport have been well characterised, systems that translocate phospholipids across the periplasm, such as MCE (Mammalian Cell Entry) transport systems, are less well understood. Here we show that E. coli MCE protein LetB (formerly YebT), forms a ~0.6 megadalton complex in the periplasm. Our cryo-EM structure reveals that LetB consists of a stack of seven modular rings, creating a long hydrophobic tunnel through the centre of the complex. LetB is sufficiently large to span the gap between the inner and outer membranes, and mutations that shorten the tunnel abolish function. Lipids bind inside the tunnel, suggesting that it functions as a pathway for lipid transport. Cryo-EM structures in the open and closed states reveal a dynamic tunnel lining, with implications for gating or substrate translocation. Together, our results support a model in which LetB establishes a physical link between the bacterial inner and outer membranes, and creates a hydrophobic pathway for the translocation of lipids across the periplasm, to maintain the integrity of the outer membrane permeability barrier.

Abstract LetB is a tunnel-forming protein found in the cell envelope of some double-membraned bacteria, and is thought to be important for the transport of lipids between the inner and outer membranes. In Escherichia coli the LetB tunnel is formed from a stack of seven rings (Ring1 - Ring7), in which each ring is composed of a homo-hexameric assembly of MCE domains. The primary sequence of each MCE domain of the LetB protein is substantially divergent from the others, making each MCE ring unique in nature. The role of each MCE domain and how it contributes to the function of LetB is not well understood. Here we probed the importance of each MCE ring for the function of LetB, using a combination of bacterial growth assays and cryo-EM. Surprisingly, we find that ΔRing3 and ΔRing6 mutants, in which Ring3 and Ring6 have been deleted, confer increased resistance to membrane perturbing agents. Specific mutations in the pore-lining loops of Ring6 similarly confer increased resistance. A cryo-EM structure of the ΔRing6 mutant shows that despite the absence of Ring6, which leads to a shorter assembly, the overall architecture is maintained, highlighting the modular nature of MCE proteins. Previous work has shown that Ring6 is dynamic and in its closed state, may restrict the passage of substrate through the tunnel. Our work suggests that removal of Ring6 may relieve this restriction. The deletion of Ring6 combined with mutations in the pore-lining loops leads to a model for the tunnel gating mechanism of LetB. Together, these results provide insight into the functional roles of individual MCE domains and pore-lining loops in the LetB protein. Highlights Deleting MCE domains 3 or 6 from LetB confers increased resistance to membrane-perturbing agents Cryo-EM structure of ΔRing6 LetB mutant highlights the modular nature of MCE domains Mutations along LetB pore-lining loops modulate detergent resistance

Abstract The outer membrane of Gram-negative bacteria provides a formidable barrier, essential for both pathogenesis and antimicrobial resistance. Biogenesis of the outer membrane requires the transport of phospholipids across the cell envelope. Recently, YhdP was implicated as a major protagonist in the transport of phospholipids from the inner membrane to the outer membrane however the molecular mechanism of YhdP mediated transport remains elusive. Here, utilising AlphaFold, we observe YhdP to form an elongated assembly of 60 β strands that curve to form a continuous hydrophobic groove. This architecture is consistent with our negative stain electron microscopy data which reveals YhdP to be approximately 250 Å in length and thus sufficient to span the bacterial cell envelope. Furthermore, molecular dynamics simulations and in vivo bacterial growth assays indicate essential helical regions at the N- and C-termini of YhdP, that may embed into the inner and outer membranes respectively, reinforcing its envelope spanning nature. Our in vivo crosslinking data reveal phosphate-containing substrates captured along the length of the YhdP groove, providing direct evidence that YhdP transports phospholipids. This finding is congruent with our molecular dynamics simulations which demonstrate the propensity for inner membrane lipids to spontaneously enter the groove of YhdP. Collectively, our results support a model in which YhdP bridges the cell envelope, providing a hydrophobic environment for the transport of phospholipids to the outer membrane.

MCE domains were first reported in Mycobacteria as having a role in Mammalian Cell Entry, with subsequent studies showing their importance during infection. Here, we have examined the function of MCE proteins in Salmonella Typhimurium during mammalian infection. We report that MCE proteins are required for Salmonella virulence, but that this is not related to decreased adherence, entry or survival in mammalian cells. Instead, we reveal that MCE proteins are required for Salmonella bile resistance, in particular to withstand bile salts such as cholate and deoxycholate. Based on our previous work in Escherichia coli, and other studies that have reported roles for MCE proteins in membrane biogenesis, we propose that Salmonella lacking MCE domains have a defective outer membrane that results in bile sensitivity and decreased virulence in vivo. These results suggest that MCE domains mediate fundamental aspects of bacterial membrane physiology as opposed to a proposed direct role in mammalian cell entry, explaining their conservation across both pathogenic and non-pathogenic bacteria.